大黄素联合5AzA-cdR增强对胰腺癌细胞ppENK抑癌基因的去甲基化作用研究

目的 研究大黄素联合5-氮-2’脱氧胞苷(5AzA-cdR)能否增强其对胰腺癌细胞抑癌基因前脑啡肽原(ppENK)的去甲基化作用。方法 选择Panc1细胞为研究对象,首先采用细胞计数实验(CCK-8)检测不同浓度大黄素对胰腺癌细胞的生长抑制情况,根据CCK-8结果选择最适大黄素用药的浓度,后将Panc1细胞分为四组:对照组、最适大黄素浓度组、5AzA-cdR组和大黄素联合5AzA-cdR用药组,采用斑点杂交实验(Dot-blot)检测四组对基因组5-甲基胞嘧啶(5mc)的影响,最后使用重亚硫酸盐测序PCR(BSP)检测四组对ppENK甲基化的影响。结果CCK-8显示,大黄素以浓度梯度和时间梯度抑制Panc1细胞生长;Dot-blot结果显示,最适大黄素浓度组和5AzAcdR组5 mc水平低于对照组,差异均有统计学意义(t分别=12.55、20.12,P均<0.05),5AzA-cdR组5 mc较最适大黄素浓度组下降明显,差异有统计学意义(t=17.76,P<0.05),大黄素联合5AzA-cdR用药组5 mc较对照组、最适大黄素浓度组以及5AzA-cdR组显著下降,差异有统计学意义(t分别=30.22、20.77、10.45,P均<0.05)。BSP结果显示,最适大黄素浓度组和5AzA-cdR组ppENK甲基化水平均低于对照组,差异均有统计学意义(t分别=14.27、21.34,P均<0.05),5AzA-cdR组ppENK甲基化水平较最适大黄素浓度组下降明显,差异有统计学意义(t=16.41,P<0.05),大黄素联合5AzA-cdR用药组ppENK甲基化水平较对照组、最适大黄素浓度组以及5AzA-cdR组显著下降,差异均有统计学意义(t分别=32.68、19.33、10.12,P均<0.05)。结论 大黄素联合5AzA-cdR可增加其对胰腺癌细胞抑癌基因ppENK的去甲基化作用。

大黄素联合5AzA-cdR对胰腺癌抑癌基因p16、RASSF1A去甲基化作用研究

目的研究大黄素是否可增强5AzA-cdR对胰腺癌Panc1细胞抑癌基因p16、RASSF1A的去甲基化作用。方法采用细胞增殖实验检测不同浓度大黄素对Panc1细胞的生长抑制情况,焦磷酸盐测序PCR(BSP)分别检测大黄素、5AzA-cdR及大黄素联合5AzA-cdR对Panc1细胞抑癌基因p16、RASSF1A甲基化状态的影响,并用荧光定量PCR(FQ-PCR)和Western blot分别检测p16、RASSF1A及甲基转移酶DNMT1、DNMT3a在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果大黄素以时间和浓度梯度依赖性抑制Panc1细胞生长。BSP结果显示大黄素具有微弱的去甲基化作用,5AzA-cdR具有-定程度的去甲基化作用,当两者联用时,去甲基化作用更加显著;FQ-PCR和Western blot结果显示大黄素与5AzA-cdR联用时,p16、RASSF1A的表达水平均较空白对照明显增高(均P<0.05),DNMT1、DNMT3a的表达水平均较空白对照明显降低(均P<0.05)。结论大黄素与5AzA-cdR联用可通过降低DNMT1和DNMT3a的表达水平来增强5AzA-cdR对胰腺癌抑癌基因p16、RASSF1A的去甲基化作用。

大黄素联合5AzA-cdR对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤抑癌基因p16、RASSF1A、ppENK的去甲基化作用

目的探讨大黄素是否增强5AzA-cdR对胰腺癌裸鼠移植瘤抑癌基因p16、RASSF1A、ppENK的去甲基化作用。方法建立胰腺癌PANC1细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,随机将裸鼠分为对照组、大黄素组、5AzA-cdR组以及大黄素联合5AzA-cdR组(联合用药组)。观察各组移植瘤的生长情况,采用甲基化特异性PCR法(MSP)检测各组移植瘤组织p16、RASSF1A、ppENK的甲基化水平,采用荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测上述3个抑癌基因mRNA和蛋白的表达量。结果对照组、大黄素组、5AzA-cdR组、联合用药组移植瘤重量分别为(0.28±0.01)、(0.17±0.01)、(0.12±0.02)、(0.08±0.01)g;体积分别为(517±0.02)、(382±0.01)、(232±0.03)、(169±0.01)mm^3;p16甲基化程度为1.00±0.00、0.89±0.02、0.63±0.02、0.19±0.01;RASSF1A甲基化程度为1.00±0.00、0.88±0.02、0.51±0.01、0.32±0.01;ppENK甲基化程度为1.00±0.00、0.92±0.02、0.77±0.02、0.31±0.01;p16mRNA表达量为1.00±0.00、1.71±0.02、2.67±0.02、3.81±0.01;RASSF1AmRNA表达量为1.00±0.00、1.92±0.02、2.73±0.03、3.77±0.01;ppENKmRNA表达量为1.00±0.00、1.69±0.03、2.17±0.02、4.28±0.01;p16蛋白表达量为1.00±0.00、1.71±0.02、2.67±0.02、3.81±0.01;RASSF1A蛋白表达量为1.00±0.00、1.92±0.02、2.73±0.03、3.77±0.01;ppENK蛋白表达量为1.00±0.00、1.69±0.03、2.17±0.02、4.28±0.01。3个治疗组移植瘤的重量及体积均显著小于对照组,3个抑癌基因甲基化程度均低于对照组,抑癌基因mRNA及蛋白表达均显著高于对照组,其中联合用药组又显著强于2个单独用药组,差异均有统计学意义(P值<0.05或<0.01)。结论大黄素联合5AzA-cdR用药可增强5AzA-cdR对胰腺癌移植瘤组织抑癌基因p16、RASSF1A、ppENK的去甲基化作用。

5AZA-CdR影响UPP1在结肠癌中的表达

目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核(5AZA-CdR)对尿苷磷酸化酶(uridine phosphorylase,UPP1)在结肠癌中表达的影响以及UPP1在多种恶性肿瘤中的表达及其与患者临床预后的相关性。方法:用5AZA-CdR处理结肠癌细胞系并进行裸鼠成瘤实验检测UPP1的表达情况。在TCGA数据库中对UPP1在多种肿瘤中的表达情况进行分析。使用在线数据库GEPIA评估UPP1m RNA表达对患者预后影响。使用cBioPortal在线软件在10945个肿瘤样本中对UPP1参与的调控网络进行预测。结果:5AZA-CdR明显抑制结肠癌细胞系SW620以及SW1116的增殖(P<0.05);用5AZA-CdR对结肠癌细胞系进行处理后UPP1表达量显著增加(P<0.05)。体内实验结果显示5AZA-CdR处理后肿瘤重量显著降低;在裸鼠模型中,5AZA-CdR处理后UPP1表达量增加(P<0.05)。通过比对23种肿瘤细胞与其相对应的正常细胞的表达谱数据,结果显示在大多数肿瘤中UPP1呈高表达状态。使用在线数据库GEPIA对肿瘤患者的生存率进行了全面的研究结果显示UPP1表达高患者的总生存率差和无病生存率均较差。通过cBioPortal在线软件对UPP1参与的调控网络进行预测,UPP1能够参与多种基因的表达调控。结论:5AZA-CdR抑制肿瘤生长并增加UPP1的表达;UPP1高表达与患者的预后不良相关,因此UPP1可能成为一种潜在的肿瘤诊断和预后因子。

大黄素对胰腺癌细胞抑癌基因P16、RASSF1A去甲基化作用研究

目的研究大黄素对胰腺癌细胞Panc1抑癌基因P16、RASSF1A启动子区CpG岛的去甲基化作用,探讨大黄素是否可以逆转抑癌基因的甲基化状态,从而使抑癌基因重新表达生物活性,发挥抗癌活性。方法采用CCK8法检测不同浓度大黄素对胰腺癌细胞的生长情况,BSP检测不同浓度大黄素处理前后P16、RASSF1A基因甲基化状态的改变,并用RT-PCR和Western blotting分别检测两个抑癌基因以及甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在mRNA和蛋白的表达情况。结果大黄素以时间梯度和浓度梯度依赖性抑制Panc1细胞生长,BSP结果证实大黄素处理后可使P16、RASSF1A甲基化状态减弱,非甲基化状态增强,同时RT-PCR和Western blotting结果证实在Panc1中低表达或无表达的mRNA和蛋白表达增强或者重新表达。结论大黄素可以对胰腺癌细胞Panc1抑癌基因P16和RASSF1A发挥不同程度的去甲基化作用,使因启动子区甲基化而失表达的抑癌基因重新表达,大黄素抑制胰腺癌细胞生长可能和其具有对抑癌基因去甲基化作用有关,并且可推测大黄素发挥去甲基化作用和其可不同程度抑制甲基转移酶表达有一定关系。