牛病毒性腹泻病毒NS5A蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

为防控牛病毒性腹泻的流行,淘选得到抗BVDV-NS5A的纳米抗体序列,并探究其结合活性。通过重组质粒pET30a-NS5A诱导表达并纯化蛋白,免疫羊驼,获得重组质粒pCANTAB 5E-VHH,构建了一个初始的抗BVDV-NS5A纳米抗体展示文库。利用3轮固相亲和筛选,对筛选后的单克隆抗体通过ELISA验证其特异性与结合力并测序、分析。构建出具有较好多样性的噬菌体展示文库,测得库容为5.3×10^(7) CFU/mL,插入率73.9%。通过评价和分析显示,得到20株不同氨基酸序列的纳米抗体,其中7株与NS5A蛋白具有较好反应性。针对抗BVDV-NS5A蛋白淘选纳米抗体,并证明得到的纳米抗体有较好的结合力。研究结果有望用于研发BVDV诊断试剂盒、抗BVDV的候选药物,同时也为后续BVDV的致病机制研究奠定了基础。

筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因

细胞内蛋白 蛋白的结合是丙型肝炎病毒 (HCV)与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白 5A(NS5A)被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子 ,参与HCV的复制、转录和信号传导等过程 ,但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系 ,作者采用酵母双杂交系统 3,在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选 ,得到 35个与NS5A特异性结合的阳性克隆 ,包括载脂蛋白、线粒体单体型基因、磷脂酸酸性磷酸酶等 11种已知功能蛋白质基因和 3个未知功能基因。

胃癌组织中RAB5A蛋白的表达及其与转移的关系

［目的］检测RABSA蛋白在胃癌组织中的表达及其与转移的关系。[方法]应用免疫组化SP方法检测47例胃癌石蜡包埋标本及7例正常胃组织中RAB5A蛋白的表达情况。［结果］正常胃组织中RAB5A蛋白表达的阳性率为0（0／7）；胃癌组织中RAB5A蛋白表达的阳性率为91．49％（43／47），两者的阳性率有显著性差异（P＜0．005）。有无淋巴结转移者的RAB5A蛋白表达的阳性率分别为91．89％（34／37）和90％（9／10），无显著性差异（P＞0．05），但两者RAB5A蛋白的表达程度有显著性差异（P＜0．05）。［结论］RAB5A蛋白的胃癌组织中高表达，且RAB5A蛋白的表达程度与胃癌转移有关。提示RAB5A可能是一个转移相关基因。

丙型肝炎病毒NS5A蛋白反式调节基因2不同剪切体调节靶基因的比较

目的:利用基因表达谱芯片技术筛选、比较丙型肝炎病毒NS5A反式调节基因2不同剪切体对HepG2细胞基因表达的调控作用及差异性.方法:利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合,克隆人NS5ATP2的不同剪切体蛋白的编码基因,常规分子生物学技术构建相应的真核细胞表达载体pcDNA3.1-NS5ATP2(615)和pcDNA3.1-NS5ATP2(216).脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2利用基因表达谱芯片技术筛选转染细胞的差异表达cDNA的类型.结果:对于2个基因剪切体转染细胞系差异表达基因谱的分析,NS5ATP2(615)和NSSATP2(216)共同上调的基因43条;NS5ATP2(615)和NSSATP2(216)共同下调的基因13条;NS5ATP2(615)上调,而NS5ATP2(216)下调的基因类型3条;未发现NS5ATP2(615)下调;NS5ATP2(216)上调的基因类型;还有一些靶基因,或只受到NS5ATP2(615)的调节,或只受到NS5ATP2(216)的调节.结论:不同剪切体的作用之间有共同的靶基因,也有不同的靶基因,甚至对于同一基因有相反的调节功能.

丙型肝炎病毒NS5A蛋白上调NS3TP6基因启动子表达活性的研究

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对NS3TP6启动子转录的激活作用. 方法:以我实验室前期研究中得到的HCV NS5A/NS3的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定NS3TP6的启动子区域(NS3TP6-p),聚合酶链反应(RCR) 扩增NS3TP6-P,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3-NS3TP6-P报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性. 结果:限制性内切酶消化和序列分析结果表明,构建的NS3TP6-p指导的报告基因表达载体pCAT3-NS3TP6-p正确无误.pCAT3-NS3TP6-p在HepG2细胞中能够启动CAT 的表达;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p+pcDNA3.1(-)- NS5A组CAT的表达活性是pCAT3-NS3TP6-P单独转染试验的1.87倍. 结论:我室克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;HCV的NS5A蛋白具有对NS3TP6基因启动子的转录具有反式激活作用.本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究HCV NS5A蛋白反式激活作用的结果,为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

RAB5A蛋白的研究进展

RAB5 A为 RAB家族成员之一 ,主管囊泡融合和囊泡再循环。自 1994年 RAB5被发现以来 ,人们逐渐认识到RAB5在细胞物质运输中起重要作用。而于 1999年以后 ,关于 RAB5 A的研究有大量报道 ,不但对其功能有了更深入的了解 ,而且对它的突变体和异构体均有一定的探讨。本文对 RAB5 A蛋白的结构、效应因子。

HCV2a(JFH1)NS5A蛋白在原核和真核细胞中的表达、鉴定及分析

目的在原核与真核细胞中表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)2a型JFH1(japanese fulminanthepatitis 1)株NS5A蛋白,分析JFH1NS5A蛋白与其它基因型NS5A蛋白间的差异,为进一步研究NS5A蛋白在HCV病毒复制中的作用奠定基础。方法PCR特异扩增JFH1NS5A基因,克隆入pET-32a和pEGFP-N1载体中,构建JFH1NS5A的原核和真核重组表达质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1NS5A。将pET-JFH1NS5A转化大肠杆菌BL21(DE3),pEGFP-JFH1NS5A转染HEK293T细胞,在原核与真核系统中进行表达,并以SDS-PAGE、荧光显微术和Westernblot方法检测。利用PubMedBLAST软件对JFH1与HCV1a、1b、2b和2c型NS5A蛋白间的同源性进行了分析。结果酶切鉴定及测序结果表明成功构建了重组质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1NS5A。SDS-PAGE电泳检测到融合蛋白在原核细胞中的表达,荧光显微镜观察和Westernblot检测到了GFP-JFH1NS5A融合蛋白在HEK293T细胞中表达。BLAST分析显示,JFH1和H77、HC-J4、HCV-J8和BEBE1病毒株NS5A蛋白的同源性分别为57%、60%、68%和74%。结论JFH1NS5A蛋白在原核与真核细胞中表达成功,为研究HCVNS5A在JFH1株病毒高效复制中的作用提供了材料。

丙型肝炎病毒NS5A蛋白的反式激活作用研究

0引言 丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒,编码一种多蛋白分子,在病毒和宿主细胞蛋白酶的共同裂解作用下,至少裂解为3种结构蛋白(C、E1和E2)和6种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[1,2].NS5 A是非结构蛋白的一种,哺乳动物细胞表达的NS5A蛋白以两种形式存在,分子量分别为56 kD和58 kD.HCV NS5A是HCV基因组编码的一种最为重要的具有多种生物学活性的非结构蛋白质[3-5],是HCV基因组编码的一种具有反式激活作用等多种生物学活性的非结构蛋白质.其基因序列的变异,决定部分HCV病毒株对于IFN-α治疗的疗效应答.HCV NS5A蛋白还具有结合双链RNA激酶(PKR)的生物学活性,对于HCV感染的靶细胞的细胞周期与细胞凋亡的分子生物学调节机制密切相关[6].

人补体片段C5a蛋白的可溶性表达、纯化及生物学活性检测

目的:为得到可溶性表达的人补体片段C5a蛋白,并检测其生物学活性。方法:用IPTG对C5a融合蛋白进行诱导表达,表达产物经肠激酶酶切后用Ni2+分离柱纯化得到C5a蛋白,通过对中性粒细胞的趋化作用、呼吸爆发、产生乳铁蛋白等实验检测C5a蛋白的生物学活性。结果:成功获得可溶性表达的C5a融合蛋白,通过肠激酶酶切后得到高纯度的C5a蛋白,C5a蛋白对人中性粒细胞具有明显的趋化作用,能引起人中性粒细胞的呼吸爆发并能诱导人中性粒细胞产生乳铁蛋白。结论:可溶性表达了具有生物学活性的人补体片段C5a蛋白,为进一步的临床研究和应用奠定了基础。

丙型肝炎病毒NS5A蛋白对Huh7细胞周期的影响

应用PCR技术从含有丙型肝炎病毒(HCV)全长开放阅读框的质粒pBRTM/HCV 1～3 011中获得NS5A全长基因片段,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中.通过酶切、PCR及测序鉴定证实,NS5A基因已正确插入到pcDNA3.1(-)中.再利用脂质体介导转染Huh7细胞,30h后收获细胞,经Western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Huh7细胞中已经获得表达.在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Huh7细胞与pcDNA3.1(-)转染的细胞在转染30h后被收集起来,乙醇固定,PI染色后利用流式细胞仪检测细胞周期变化.G0/G1期由60.6%下降到49.7%,S期由23.9%上升到32.7%,而转染pcDNA3.1(-)细胞的细胞周期与正常的Huh7细胞则差别不大.从而证明HCV NS5A蛋白对Huh7细胞周期具有调节作用.

乳腺癌组织中Wnt5a蛋白的表达与临床病理参数及预后的关系

目的观察Wnt5a蛋白在乳腺癌组织中的表达情况,并分析其与乳腺癌相关临床病理参数的关系,初步探讨Wnt5a蛋白在人乳腺癌发生、发展过程中的作用。方法采用免疫组化S-P法检测80例乳腺浸润性导管癌组织及相应癌旁组织中Wnt5a蛋白的表达。结果 Wnt5a蛋白在乳腺癌和癌旁组织中的阳性表达率分别为33.8%(27/80)和63.8%(51/80),差异有统计学意义(P<0.05);乳腺癌组织中Wnt5a蛋白的表达与淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05);与ER和PR的表达呈正相关(rs=0.294、0.316,P<0.05)。结论乳腺癌组织中Wnt5a蛋白的表达减少,提示其在乳腺癌发生、发展中发挥重要作用,有可能成为乳腺癌早期诊断和预后判断的指标及治疗的新靶点。

丙肝病毒NS5A蛋白对NS5B的RdRP活性影响的研究

丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus,HCV )非结构蛋白 (Nonstructural,NS) 5 A在 HCV基因组复制中的作用目前尚不清楚。本文研究 His- NS5 A对 NS5 B的 RNA依赖性 RNA酶 (Rd RP)活性的影响 ,以了解 NS5 A在HCV RNA复制中的作用。采用变性 -复性方法 ,纯化大肠杆菌表达的重组组氨酸 NS5 A融合蛋白。 GST结合洗脱实验 (GST pull- down assay)研究 NS5 A和 NS5 B是否结合。以不同的摩尔浓度比 ,将纯化的 NS5 B和 NS5 A蛋白混合 ,检测 NS5 A对 NS5 B的 Rd RP活性的影响。获得高得率的纯化 His- NS5 A蛋白。重组 NS5 A蛋白可在体外与NS5 B结合并抑制后者的 Rd RP活性。本研究报道了纯化重组 His- NS5 A蛋白的变性 -复性方法 ,结果显示纯化的重组 NS5 A在体外可与 NS5 B相互结合 ,并明显抑制 NS5 B Rd RP活性。提示了 HCV NS5 A在病毒复制中的可能作用。

长链非编码RNA TINCR、Wnt5a蛋白及β-catenin蛋白在重度子痫前期胎盘组织中的表达及临床意义

目的:研究重度子痫前期(SPE)患者胎盘组织中终末诱导分化长链非编码RNA-TINCR (TINCR)、Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的表达及临床意义。方法:选取2016年4月至2018年4月于中国医科大学附属盛京医院妇产科行剖宫产分娩的SPE患者30例(SPE组)和正常妊娠孕妇30例(对照组)。Real-time PCR(RT-PCR)法检测患者胎盘组织中TINCR相对表达水平,Western blot法及免疫组化法检测胎盘组织中Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的表达及定位情况。分析母婴不良预后与三者表达水平的相关性。结果:RT-PCR结果显示,SPE组胎盘组织中TINCR相对表达水平高于对照组,差异有统计学意义(2.424±1.125 vs 1.128±0.536,P<0.001)。Western blot结果显示,Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白均表达于胎盘组织中,SPE组胎盘组织中Wnt5a、β-catenin蛋白表达水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.001,P<0.01)。免疫组化法显示,胎盘组织的细胞滋养细胞和合体滋养细胞细胞中均有Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白表达,其中Wnt5a蛋白主要在合体滋养细胞的细胞质中表达,β-catenin蛋白主要在细胞滋养细胞的细胞质中表达。TINCR高表达及Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白低表达可能与孕妇入院平均动脉压有关。结论:TINCR高表达及Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白低表达可能参与PE的发病机制。

ORF5a蛋白引起的免疫反应对抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染无保护作用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种有包膜RNA病毒,可使猪患猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),此病可引起全球重要的动物福利和经济问题。目前,尚无具体的治疗方案和可变有效的免疫保护。毒力、发病机理和保护性免疫反应的分子机制仍知之甚少。这些因素限制研发防制PRRS有效措施的进展。最近研究结果显示,鉴定出一个新的PRRSV ORF5a蛋白,它由一个与主要囊膜糖蛋白GP5的开放阅读框(ORF)部分重叠的ORF编码。由于ORF5a在不同PRRSV分离株中高度保守,是病毒粒子的结构蛋白,可在感染猪上诱导特异的抗体反应,作者研究了ORF5a蛋白在抵抗PRRSV感染的免疫保护中的潜在作用。结果显示,免疫ORF5a蛋白的猪有强烈的血清学反应。但是,抗体不中和病毒,且免疫不能防制病毒感染。试验结果表明,ORF5a引起的抗体反应既不起中和作用,也不起保护作用。

温石棉对内皮细胞Wnt5a、p16和p21表达的影响

目的探讨温石棉对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的影响。方法实验组以50、100、200 mg/L温石棉纤维液刺激HUVECs 24、48、72 h,对照组仅加RPMI 1640培养基培养细胞,观察细胞形态变化,β-半乳糖苷酶法分析细胞衰老情况,四甲基偶氮唑蓝法检测细胞存活率。采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Wnt5a、p16和p21 mRNA的表达情况。结果实验组HUVECs多呈梭形,部分呈圆形或不规则形,出现裸核及空泡现象,可见死亡细胞。随温石棉质量浓度及暴露时间的增加,细胞活性逐渐降低,衰老细胞逐渐增多。100 mg/L温石棉处理HUVECs 24 h时,细胞生长较活跃。与对照组相比,实验组Wnt5a、p16和p21 mRNA表达水平均增高(P<0.05)。结论温石棉可促进HUVECs衰老,Wnt5a、p16和p21参与此过程。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5a蛋白在大肠埃希菌中的表达

构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)HuN4株GP5a蛋白基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中进行表达。以HP-PRRSV HuN4株GP5a蛋白的基因序列为模板,通过RT-PCR扩增获得GP5a蛋白全长基因片段,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建含有GP5a蛋白基因的重组表达载体pGEX-GP5a;将构建的重组质粒转化宿主菌,经IPTG诱导,表达出目的蛋白;表达蛋白采用Western blot方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆出了HP-PRRSV HuN4株GP5a蛋白基因全长,片段序列为156bp;构建的pGEX-GP5a载体经PCR、双酶切、测序鉴定均正确,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测目的蛋白以包涵体的形式表达,用包涵体纯化法获得该蛋白;Western blot检测表达蛋白的反应原性,结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。本试验成功构建了含有HP-PRRSV HuN4株GP5a蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了GP5a蛋白,为进一步研究GP5a蛋白的功能提供材料。

丙型肝炎病毒非结构5A蛋白(NS5A)抑制剂研究进展

非结构5A蛋白(NS5A)是治疗丙型肝炎病毒感染的新靶标。尽管NS5A蛋白不具备酶催化活性,但它对病毒RNA复制起着重要作用。NS5A蛋白的小分子抑制剂显示出很强的体外抑制病毒生长的活性,并且初步的临床评价也证实了NS5A抑制剂能很好的抑制体内丙型肝炎病毒的生长。因此,研发高效的NS5A小分子抑制剂为治疗丙型肝炎提供了新的策略。本文综述了NS5A抑制剂的结构类型、构效关系、生物活性和作用机制等方面的研究进展。

稳定表达猪瘟病毒NS5A蛋白的细胞系的建立

为了探索猪瘟病毒非结构蛋白5A(NS5A)的功能,成功扩增了猪瘟病毒NS5A基因的DNA片段并构建了猪瘟病毒NS5A基因的重组表达质粒pGFP-NS5A和pNS5A-GFP。然后,将阳性质粒pGFPNS5A、pNS5A-GFP和对照质粒pEGFP-C1在Lipofectamine 2000介导下转染猪血管内皮细胞(SUVEC),活细胞状态下直接观察GFP-NS5A和NS5A-GFP蛋白在SUVEC细胞中的表达与定位。结果显示,猪瘟病毒NS5A蛋白主要定位于细胞质中;进一步的激光共聚焦共定位显示,NS5A蛋白主要定位于SUVEC细胞的内质网上面。在此基础之上,通过含有1 500μg/mL新霉素(G418)的抗性培养基筛选出稳定表达猪瘟病毒NS5A蛋白的细胞克隆。RT-PCR和Western-blot检测结果表明,猪瘟病毒NS5A蛋白可以在SUVEC细胞中稳定转录和表达。上述结果表明,本研究建立了稳定表达猪瘟病毒NS5A蛋白的SUVEC细胞株,为进一步研究NS5A蛋白对SUVEC细胞的生理功能的影响及其在猪瘟病毒致病过程中的作用奠定了基础。