苦参碱对脑胶质瘤C6细胞系的诱导分化

目的 观察苦参碱对脑胶质瘤C6细胞株体外增殖的影响。方法 应用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测苦参碱对C6细胞增殖的抑制作用 ,采用流式细胞仪观察苦参碱对C6细胞周期的影响 ,以免疫组化SABC染色法检测胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillaryacidicprotein ,GFAP)表达 ,用以了解胶质瘤细胞分化的情况。结果 苦参碱对C6细胞增殖抑制作用明显 ,在终浓度为 0 .5mg·ml-1时 ,对C6增殖的抑制率达 (2 4 .4± 0 .9) %。经流式细胞仪分析显示 ,用 0 .5mg·ml-1苦参碱培养 72h ,C6细胞出现了明显的增殖抑制现象。免疫组化SABC染色法可见C6用药组较对照组GFAP表达明显增强。结论 苦参碱对鼠胶质瘤C6细胞系的增殖有明显的抑制作用 ,发生了诱导分化现象。

重组人睫状神经营养因子对大鼠胶质细胞瘤C_6细胞系生长的影响

本研究观察了重组人睫状神经营养因子（ｒｈＣＮＴＦ）对大鼠胶质瘤Ｃ６细胞系生长的影响。发现ｒｈＣＮＴＦ２０～２０００ｎｇ／ｍｌ可抑制Ｃ６细胞增殖，细胞形态发生明显改变，且具有剂量─时间效应。此外，ｒｈＣＮＴＦ还可诱导Ｃ６细胞分泌少量ＩＬ─６。结果表明，ｒｈＣＮＴＦ对Ｃ６细胞的抑制作用可能与其参与瘤细胞的生长调节有关，推测ｒｈＣＮＴＦ作为一种细胞调节因子对胶质瘤具有潜在治疗作用。

骨髓间充质干细胞对大鼠脑胶质瘤C6细胞系分化的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)对大鼠脑胶质瘤C6细胞系分化的影响及其相关机制。方法用Transwell小室共培养BMSCs与C6细胞,采用细胞计数法检测C6细胞增殖水平;流式细胞术检测C6细胞的细胞周期;免疫荧光与免疫组化法分别检测波形蛋白(vimentin)和胶质纤维酸性蛋白(Glia lfibrillary acidic protein,GFAP)的表达;生化法检测谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)的活性。结果 BMSCs对C6细胞的增殖具有抑制作用;与BMSCs进行双层培养72h的C6细胞出现G0/G1期细胞周期阻滞,双层培养组的C6细胞GFAP表达明显增强,同时vimentin表达减弱,并且这两种分化标志物在细胞内的分布及排列发生了改变;双层培养组C6细胞内GS活性升高。结论 BMSCs能诱导C6细胞向成熟星形胶质细胞分化,可能与BMSCs分泌的某些细胞因子有关。

悬浮法培养C6胶质瘤细胞系和该细胞系中脑肿瘤干细胞的分离

目的研究应用无血清培养基悬浮法培养C6胶质瘤细胞系的方法;并分离该细胞系中的脑肿瘤干细胞,观察其生长方式和分化特征。方法应用培养大鼠神经干细胞的培养基和培养方法,在无血清培养基中采用悬浮法培养大鼠C6胶质瘤细胞系;再将分离获得的悬浮生长的脑肿瘤干细胞接种于含血清培养基,观察其分化;应用有限稀释和单克隆形成实验确定该细胞系中肿瘤干细胞的比例。结果C6胶质瘤细胞系中有约1.18%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活、增殖,形成自由漂浮的细胞球;这种细胞球具有人脑肿瘤干细胞球的特征,并可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,贴壁分化后细胞形态与直接在含血清培养基中培养的C6胶质瘤细胞系无明显差别。结论C6大鼠胶质瘤细胞系中含有比例较低的、具有增殖和分化能力脑肿瘤干细胞(约1.18%),该细胞系可在含生长因子的无血清培养基中悬浮生长,并维持细胞系。

核糖核酸酶抑制因子对H_2O_2损伤的大鼠神经胶质瘤细胞系C6的影响

核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor,RI)是广泛存在于哺乳动物细胞浆中的一种酸性糖蛋白 .为了进一步了解RI的功能 ,根据RI分子结构富含巯基的特点 ,研究了RI对过氧化氢(H2 O2 )损伤的大鼠神经胶质瘤细胞 (C6 )的影响 .用不同浓度的H2 O2 分别作用于转染有RIcDNA并且RI过表达的C6细胞和正常C6细胞 ,对比损伤前后 2者的细胞存活率、LDH漏出量、细胞内GSH和MDA含量差别 ,以及细胞内抗氧化酶类GPX、CAT和GST活性的差别 .结果表明 ,与正常C6细胞相比 ,RI过表达的C6细胞在H2 O2 作用下存活率高 ,LDH漏出量、MDA含量明显减少 ,而细胞内GSH较多 ;RI过表达的C6细胞在损伤前后均表现出更强的CAT和GST活性 .提示RI具有抗氧化功能 ,能够减轻H2 O2 所致的细胞过氧化损伤 .

用于全基因组易位测序的Nalm6-Cas9细胞系的构建

目的:为进行基于CRISPR-Cas9的全基因组高通量易位测序,利用慢病毒转导构建表达Cas9蛋白的Nalm6-Cas9单克隆细胞系。方法:使用慢病毒载体lentiCas9-Blast、psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞包装病毒,病毒感染Nalm6细胞后使用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,通过有限稀释法获得多个表达Cas9蛋白的单克隆细胞株。Western blot检测单克隆细胞株中Cas9蛋白的表达水平,细胞计数检测单克隆细胞株的细胞增殖活性。构建lentiCRISPRv2GFP-Δcas9、lentiCRISPRv2GFP-Δcas9-AF4、lentiCRISPRv2GFP-Δcas9-MLL质粒,并分别与pSPAX2、pMD2.G质粒共转染包装病毒,收集病毒感染Nalm6-Cas9单克隆细胞株,使用T载体克隆检测单克隆细胞株的Cas9蛋白的功能。结果:Western blot结果显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株高水平表达Cas9蛋白;细胞计数分析结果显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株细胞增殖活性与对照细胞比较无显著差异;T载体克隆检测显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株Cas9蛋白具有高水平切割活性,对AF4和MLL基因的编辑效率在90%以上。结论:本研究得到了稳定表达高活性Cas9蛋白的Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株,为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量易位测序技术探究治疗相关性白血病中MLL易位连接机制提供依据。

规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9靶向Rho GDIα基因敲除质粒的构建及其对小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6迁移的影响

目的利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染入Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异。结果成功构建了Rho GDIα的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P<0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P<0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高。结论CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移。

黄芪多糖对HSC-T6细胞增殖及胶原产生的影响

目的 :研究黄芪多糖 (APS)对体外HSC T6细胞增殖和胶原合成的影响。方法 :采用血清刺激大鼠肝星状细胞 (HSC T6 ) ,用 [3 H] TdR和 [3 H] Proline掺入法分别检测其增殖和胶原合成的活性。结果 :低浓度APS可明显降低由血清刺激的HSC T6细胞的增殖和胶原合成的活性。高浓度APS (≥80mg·L-1)可明显促进HSC T6细胞增殖。结论 :低浓度APS对HSC T6细胞的增殖和胶原合成的活性有抑制作用 ,且APS对HSC T6细胞增殖有双向调节作用。

反义RelA下调白血病耐药细胞株HL-60/E6 bcl-x_L mRNA

为了探讨NF κB对白血病耐药细胞株HL 6 0 E6bcl x基因转录的影响 ,首先在体外采用间歇小剂量表阿霉素 (6ng ml)作用于HL 6 0细胞的方法 ,建立了性能稳定的广谱耐药细胞株HL 6 0 E6。然后用RT PCR方法检测 5 μmol L硫代修饰反义RelA作用于HL 6 0 E6细胞后bcl x基因mRNA水平的变化。同时应用免疫荧光技术和流式细胞术分别对HL 6 0 E6细胞中NF κB RelA的功能状态及脂质体作为寡核苷酸载体的转染效率进行评估。结果表明 ,在HL 6 0 E6细胞中RelA表达于胞核 ,NF κB处于持续活化状态。脂质体介导的寡核苷酸 (ODN)的转染效率明显高于裸ODN组 ,在 4 ,6和12小时时有显著差异 (P <0 .0 1)。反义RelA作用于HL 6 0 E6细胞后 ,bcl xL mRNA水平下降呈时间依赖性 ,8小时抑制达到最高峰 ,15小时后逐渐恢复 ,而对照组bcl xL mRNA水平变化不明显。分析结果认为 ,NF κB对bcl x有转录调节作用 ,反义技术封闭RelA亚基可以减弱NF κB对bcl xL 基因的转录激活 ,进而推测NF κB可能是白血病细胞耐药的一个重要因子。

超氧阴离子自由基对小鼠乳腺癌细胞株EMT6的促增殖作用

目的:探讨低剂量超氧阴离子自由基(O2-)对小鼠乳腺癌细胞株EMT6的促增殖作用及该作用与NF-κB和细胞周期的关系。方法:黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(XaXO)系统产生的不同剂量O2-直接作用于培养的EMT6细胞,筛选刺激EMT6细胞增殖的最佳剂量:20μmol/LNF-κB抑制剂(PDTC)预处理细胞2h,5.0mU黄嘌呤氧化酶(XO)体系产生的O2-作用EMT6细胞,5.0mVXO体系产生的O2-分别作用于G1、G2/M、S期EMT6细胞,MTT法测定细胞增殖活性。结果:5.0mUXO体系产生的O2-具有明显的促进EMT6细胞生长的作用,此作用可以被PDTC抑制;5.0MuXO体系产生的O2-可以明显的促进G1期EMT6细胞生长。结论:低剂量O2-可诱导EMT6细胞增殖,该过程可能包含依赖NF-kB的信号途径的参与;O2-诱导EMT6细胞增殖时存在细胞周期敏感时相,该敏感时相为G1期。

抑制Jak3激酶活性诱导NALM-6白血病细胞凋亡

目的 研究 Jak3的活化与急性淋巴细胞白血病 (AL L)之间的关系。方法 在不同浓度的 Jak3抑制剂 AG490处理 Jak3活化的 AL L 前 B细胞株 NAL M- 6细胞后 ,用流式细胞术及噻唑蓝法分析细胞的凋亡、增殖情况。结果 除 5 μm ol/ L 组外 ,经 10、15、2 0 μm ol/ L AG490处理后 NAL M- 6细胞均有明显的亚 G1 峰 ,与 DMSO对照相比 ,凋亡率均有显著增加 (P<0 .0 5 ) ;噻唑蓝法示除 5 μmol/ L 组外 ,与 DMSO对照相比 ,10、15、2 0 μm ol/ LAG490均能显著抑制 NAL M- 6细胞的增殖 (P<0 .0 5 )。以上作用呈剂量依赖性关系。结论 Jak3抑制剂 AG490能抑制 NAL M- 6细胞的增殖并诱导凋亡 ,提示 Jak3的活化与前 B型 AL L

C6细胞肝与脾原位接种模型的建立及比较

目的探讨大鼠肝癌细胞系C6肝与脾原位接种成瘤在不同内环境情况下对肿瘤发生与侵袭转移等能力的影响,并筛选最佳C6肝细胞癌肺转移动物模型。方法 C6进行体外培养。将雌性BALB/cA裸鼠随机分为肝与脾原位接种2组。观察裸鼠C6成瘤率、裸鼠存活率、肿瘤病理学特点和远处脏器癌细胞转移等情况。结果肝原位接种组成瘤率100%,肿瘤呈结节状膨胀性生长,对周围肝组织和腹壁有粘连、侵袭,肺转移率100%。脾原位接种组脾成瘤率100%,肿瘤呈结节状膨胀性生长,对周围组织和腹壁亦有粘连、侵袭,肝、肺转移率分别为100%和71.4%。结论 C6细胞肝和脾原位接种均易成瘤和转移,可作为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)体内研究和转移模型。脾原位接种模型可能与HCC自发性肿瘤发生和转移的生物学特性更相似,更适合于HCC发生和转移的机制,以及治疗干预等研究。

鱼精蛋白体外抑制RF/6A细胞中血管内皮生长因子表达的研究

目的研究鱼精蛋白对体外培养的RF/6A细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的抑制作用。方法建立RF/6A细胞的正常及缺氧培养模型,在上清液中加入鱼精蛋白,质量浓度分别为10、20、40、80、160μg/mL。在细胞培养的0、24、48、72、96、120h取上清液行ELISA检测,定量分析细胞的VEGF表达情况。在培养96h时,取出细胞铺片行免疫病理学检测,检测VEGF与受体的结合状况。结果在10～80μg/mL的范围内,鱼精蛋白的抑制作用与质量浓度成正比,80μg/mL为最佳的抑制质量浓度。缺氧条件下RF/6AVEGF的表达量始终高于正常氧浓度条件下;正常和缺氧状态下,鱼精蛋白均可以明显抑制VEGF的表达,不同组的差异有统计学意义(F=7.85,P=0.002)。免疫病理染色表明鱼精蛋白减少了VEGF与其受体的结合。结论一定质量浓度的鱼精蛋白对正常及缺氧状态下的RF/6AVEGF的表达有明确的抑制作用,同时还可以减少VEGF与VEGF受体的结合。鱼精蛋白有可能成为临床治疗缺血型新生血管性眼底病的新药。

从鼠黑色素瘤细胞系中分离和鉴定癌干细胞样细胞

目的:从鼠黑色素瘤BL6F10细胞系中分离与鉴定癌干细胞(CSC)样细胞,为今后对CSC的鉴定及靶向治疗奠定基础。方法:用不同免疫磁珠标记的单克隆抗体,从BL6F10细胞系中分离有特征性CD表型的瘤细胞,体外观察不同CD表型瘤细胞在软琼脂培养基上形成克隆的能力;将这些瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠,比较其致瘤性。结果:从BL6F10细胞系中分离出不同CD表型的特征性瘤细胞;在软琼脂培养基上,CD133+、CD44+和CD44+CD133+细胞克隆形成率分别高于CD133-、CD44-和CD44+CD133-细胞;CD133+、CD44+、CD44+CD133+和CD44+CD133+CD24+细胞在小鼠体内的致瘤性分别强于CD133-、CD44-、CD44+CD133-和CD44+CD133+CD24-细胞。结论:CD44+CD133+CD24+表型的BL6F10细胞的某些生物学特性与CSC样细胞相似,具有CSC特征,这些实验结果为进一步鉴定BL6F10细胞系中的CSC提供了重要的实验资料。

TLR4全长及其截断体重组腺病毒对Rf-6A细胞骨架的影响

为了研究LPS受体TLR4全长及其胞内段缺失的TLR4截断体(驻TLR4)的绿色荧光蛋白重组腺病毒对内皮细胞系Rf-6A骨架蛋白的影响,采用PCR方法扩增目的基因片段,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,用BJ5183细菌同源重组法将目的基因重组于腺病毒骨架载体,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后,用脂质体法转染293细胞进行腺病毒的包装扩增,用重组腺病毒感染Rf-6A细胞,采用免疫荧光标记方法观察结果。免疫荧光标记结果表明Ad-驻TLR4明显抑制了LPS引起的细胞骨架F-actin的解聚与重排,Ad-TLR4则使LPS引起的F-actin应力纤维产生增强。以上结果说明TLR4全长及其截断体的重组腺病毒感染内皮细胞对LPS诱导的细胞骨架变化具有不同的影响,Ad-驻TLR4对LPS引起的内皮细胞骨架变化具有抑制作用。

胶质瘤C6肿瘤干细胞蛋白质组学初步分析

目的:运用蛋白质组学的方法,对C6脑肿瘤干细胞(BTSC)和非BTSC细胞进行配对研究,建立差异性蛋白文库,为探讨胶质瘤病因提供初步线索。方法:在C6细胞中,参照神经干细胞(NSC)培养条件进行培养。出现典型的神经球后,利用免疫荧光染色检测细胞标记,包括nestin,神经元特异性烯醇化酶(NSE),神经胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)等,以及诱导分化等方法,鉴定神经球细胞是否为BTSC。收集神经球和非神经球细胞,进行配对,利用双向凝胶电泳(2D-PAGE)检测细胞总体蛋白,分析差异性蛋白点。结果:C6细胞在NSC培养条件下,出现比较典型的神经球。神经球细胞nestin阳性,NSE和GFAP阴性。经诱导发生分化,分化后细胞形态与C6相似,能够表达NSE和GFAP等多种表型细胞标记,证实这种神经球细胞为肿瘤干细胞。在2D-PAGE结果中,C6肿瘤干细胞和非干细胞配对比较,有统计学差异(P<0.05)的蛋白点共有84个,大于2倍差异蛋白点有50个,大于3倍的有17个,大于4倍的有6个,最大差异倍数为11.607 2。在BTSC中,有55个差异蛋白表达增多(上调),29个蛋白表达下降(下调)。结论:胶质瘤C6细胞系中存在肿瘤干细胞,在蛋白质组学方面与非BTSC细胞有明显差异。

SDF-1/CXCR4在恶性胶质瘤细胞体外增殖、迁移及侵袭中的作用

目的探讨趋化因子SDF-1及受体CXCR4在恶性胶质瘤细胞中的增殖、迁移及侵袭的作用,为临床治疗提供依据.方法免疫组化法检测CXCR4在恶性胶质瘤C6细胞中的表达;用MTT法分别检测不同浓度的趋化因子SDF-1促恶性胶质瘤C6细胞体外增殖,并应用CXCR4受体抑制剂AMD3100与SDF-1共培养细胞观察增殖情况及抗CXCR4单克隆抗体在恶性胶质瘤中上述指标的变化.通过细胞迁移实验和细胞侵袭实验评价不同处理组C6细胞的迁移和侵袭能力.结果 CXCR4在恶性胶质瘤C6细胞系表达呈阳性.SDF-1可以促进恶性胶质瘤C6细胞的体外增殖、迁移和侵袭,而抗CXCR4单克隆抗体可以有效抑制其增殖、迁移和侵袭,并呈浓度依赖性.AMD3100可以抑制SDF-1的诱导作用.结论 SDF-1/CXCR4轴在恶性胶质瘤细胞株的体外增殖、迁移及侵袭中的作用,可能与恶性胶质瘤的侵袭和转移有关,为治疗恶性胶质瘤提供新的治疗策略.

基于味觉细胞传感器的人工甜味剂识别方法的研究

根据目前的研究结果,某些人工甜味剂对人体是无毒无害的,如三氯蔗糖;然而某些甜味剂对人体健康是有不同程度的副作用,如阿斯巴甜、糖精。所以对食品中不同种类的人工甜味剂进行识别是非常有必要的。

GFP报道基因转染大鼠C6胶质瘤细胞系动态表达的研究

目的:研究绿色荧光蛋白报道基因体外转染C6胶质瘤细胞系的动态表达。方法:脂质体转染后荧光显微镜筛选荧光克隆、激光共聚焦显微镜观察荧光蛋白在细胞内分布,并分析荧光蛋白转染细胞后对其增殖能力的影响。结果:荧光蛋白主要分布在细胞核周围区域。冻存后复苏对细胞存活和荧光强度没有明显影响。C6细胞的增殖没有明显变化。结论:荧光蛋白可以作为胶质瘤基因转染时的优选报道基因。