6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutD)基因克隆、测序和表达

本研究根据6 磷酸山梨醇脱氢酶基因(gutD)两端序列设计引物,以假单胞杆菌(PseudonmonasXM)的总DNA为模板通过PCR的方法克隆gutD基因并进行序列分析.将克隆得到的gutD基因与原核表达载体pBV220连接并转化大肠杆菌(Es cherichiacoli)JM101后检测其蛋白表达及菌株生长耐盐性.

6-磷酸山梨醇脱氢酶基因转化水稻(Oryza sativa L.)研究

以水稻品种秀水 1 1的幼胚为外植体 ,对影响愈伤组织诱导及植株再生的因素进行了研究 .结果表明 :MS+2 ,4- D 2 mg/L作培养基 ,愈伤组织诱导率达 1 0 0 % ,愈伤组织在 MS+6- BA2 mg/L+NAA 0 .1 mg/L的培养基上 ,分化频率高达 75.3% ;在此基础上利用基因枪转化技术 ,将外源的 6-磷酸山梨醇脱氢酶基因 (gut D)导入水稻基因组 ,转基因植株表现出对 Na Cl较强的耐性 .

副干酪乳杆菌6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutF)基因的克隆和超表达

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶基因在乳酸菌中超表达的影响,本试验根据副干酪乳杆菌的基因序列设计引物,用PCR的方法扩增6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutF)基因,将其连接到乳酸菌表达载体pMG36e,并将重组质粒转化到副干酪乳杆菌及乳酸乳球菌中获得重组菌株;对重组菌株表达产物进行蛋白质水平的电泳检测,检测出表达了大约28kD的蛋白;使用山梨醇替代培养基中的葡萄糖,以未转化基因菌株做阴性对照,进行生长曲线的测定,结果表明,转化菌株能够利用在以山梨醇作为碳源的条件下,重组菌株的生长速度和最终菌浓度均优越于对照菌株。本研究通过超表达6-磷酸山梨醇脱氢酶蛋白,对于进一步研究乳酸菌的耐受性具有十分重要的理论基础。

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子的转化及其转录活性

【目的】研究6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子(S6PDHp)的组织表达特点。【方法】利用Gateway技术构建了S6PDHp与GUS基因的融合表达载体,然后通过农杆菌介导法转化番茄"中蔬5号",对转基因植株进行PCR检测,对鉴定为阳性的植株进行GUS组织化学染色,验证S6PDHp的组织表达特性。【结果】将S6PDHp-GUS融合表达载体转化番茄,经PCR检测显示,成功获得了转S6PDHp基因的阳性番茄植株。对阳性植株各组织器官的GUS化学染色和活性检测结果显示,除叶片外许多器官都有很强的GUS活性,且在转基因番茄成熟期植株的茎部活性最高,根部活性最低;叶片从新叶到老叶的各个时期,GUS活性持续降低。【结论】S6PDHp表达在植物衰老过程中降低;且在转基因番茄茎部的GUS活性最强,说明该启动子具有组织表达特异性。

共转染小干扰RNA质粒联合抑制HeLa细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和转酮醇酶样基因-1表达

目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)及转酮醇酶样基因-1(transketolase like-1,TKTL-1)是肿瘤细胞磷酸戊糖代谢途径(pentose phosphate pathway,PPP)的2个重要关键调节酶。拟通过共转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体同时沉默人宫颈癌Hela G6PD及TKTL-1后,观察其对G6PD和TKTL1的联合抑制作用,旨在探讨共转染siRNA表达载体联合抑制PPP的效果及可行性。方法分别构建靶向G6PD和TKTL1基因siRNA干扰质粒载体,通过酶切和测序鉴定siRNA干扰质粒载体构建成功后,单独或共转染HeLa细胞株,RT-PCR检测G6PD、TKTL1 mRNA表达并结合G6PD、转酮醇酶(transketolase,TKT)活性测定判断并比较共转染联合抑制Hela细胞G6PD、TKTL1表达的效果。结果共转染靶向G6PD和TKTL1基因的siRNA干扰载体能显著下调G6PD和TKTL1基因表达水平[(0.96±0.05)vs(0.47±0.04),(0.98±0.05)vs(0.41±0.04),P<0.01]。同时,2个酶的活性也显著下降(99.2%vs34.5%和99.8%vs 40.1%,P<0.01)。共转染抑制G6PD基因mRNA表达较单独转染靶向G6PD基因的siRNA干扰载体的效果有显著下降[(0.47±0.04)vs(0.31±0.04),P<0.01)]。结论共转染siRNA干扰载体对人宫颈癌HeLa细胞PPP代谢通路进行联合抑制是一种有效的实验方案。

植物6-磷酸山梨醇脱氢酶

6-磷酸山梨醇脱氢酶是植物合成山梨醇的关键酶。文章从酶学特性、山梨醇转化、碳水化合物代谢等方面对6-磷酸山梨醇脱氢酶的研究进展以及此酶的某些应用研究情况作介绍。

1-磷酸甘露醇脱氢酶基因转化水稻的研究

PCR和 Southern blotting检测表明 ,来自大肠杆菌的 mtl D基因已通过农杆菌介导整合进水稻基因组。mtl D基因在 T1代出现分离 ,T2 代出现纯系。在 0 .75% Na Cl胁迫下 ,7个转基因 T3 代株系都能检测到 mtl D酶活性 ,与对照相比细胞膜的相对电导率和大分子渗漏值明显降低。部分转基因株系能在 1 .0 % Na Cl浓度下正常生长 ,而对照在 0 .5% Na Cl浓度下已不能存活。通过有性杂交途径实现了 mtl D和 gut D两个基因的聚合 ,部分杂交后代株系能在 1 .2 5% Na Cl胁迫下正常生长结实。

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子逆境诱导表达特性研究

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因启动子(S6PDHp)的逆境诱导表达特性,利用Gateway技术构建了S6PDH基因启动子区5'端系列缺失体与GUS基因的融合表达载体,并通过农杆菌介导法转化拟南芥。对转基因拟南芥进行低温和外源ABA处理,通过GUS蛋白活性变化分析S6PDHp的逆境诱导表达特性。研究结果发现,通过Gateway技术构建了4个S6PDHp 5'端系列缺失体与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的融合表达载体(pGWB433-S6PDHp1、pGWB433-S6PDHp2、pGWB433-S6PDHp3和p GWB433-S6PDHp4)并获得了相应的转基因拟南芥。对转基因植株进行低温处理后发现,p GWB433-S6PDHp3转基因植株中的GUS活性增幅最大,达到显著水平,而其他转基因植株中的GUS活性基本保持不变。外源ABA处理后发现,除p GWB433-S6PDHp4外,其余启动子缺失体转基因拟南芥中GUS活性显著升高。以上结果表明,低温和外源ABA能够诱导S6PDHp的表达,但不同的缺失体响应程度不同,意味着在S6PDHp序列(-2 396bp至-236bp)中可能存在着响应逆境胁迫的正负调控顺式作用元件。

蔷薇科植物中山梨醇代谢酶的研究进展

蔷薇科植物中,与山梨醇代谢相关的酶主要有:6-磷酸山梨醇脱氢酶、山梨醇脱氢酶和山梨醇氧化酶。综述了近些年来国内外关于这几种酶的研究进展,涉及的内容有:酶的性质与作用、酶的活性变化与转录的关系,及其在生物技术方面的研究成果,并对今后的研究工作进行了展望。

梨树山梨醇代谢及其调控因子研究进展

山梨醇是梨树等蔷薇科植物最主要的光合作用产物和碳水化合物转运形态。山梨醇代谢是梨树最重要的糖类生化过程之一,其不仅影响了果实内在品质的形成,而且也为营养物质合成提供了基础原料。本文综述了山梨醇合成、转运以及分解过程,重点介绍山梨醇代谢过程中主要相关酶（6-磷酸山梨醇脱氢酶和山梨醇脱氢酶）以及转运蛋白基因SOT在梨树中的研究进展,并对今后的研究工作进行了展望,以期为进一步深入研究山梨醇代谢机制和提高梨果品质提供参考。

苹果S6PDH基因克隆与原核表达

6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)是蔷薇科植物中合成山梨醇的重要酶。以苹果叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到S6PDHcDNA全长,将其与大肠杆菌表达载体pET-32a(+)构建原核表达载体pET-S并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测结果表明该基因表达了1个约54kD的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了试验基础。

楸子S6PDH基因启动子活性鉴定

利用同源PCR技术从楸子(Malus prunifolia)基因组DNA中扩增得到6-磷酸山梨醇脱氢酶(Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因的启动子并命名为Mp-S-P。对启动子序列的顺式作用元件进行预测分析发现,Mp-S-P序列中除了含有植物启动子的基本结构元件外,还有多个与胁迫和激素诱导相关的元件。以β-葡萄糖苷酸酶(beta-glucuronidase,GUS)作为报告基因,构建含有pMp-S-P-GUS的融合表达载体并通过根癌农杆菌瞬时转化烟草叶片,然后分析该启动子对不同外界条件的响应。结果表明:低温、水杨酸和赤霉素处理可以提高该启动子的活性,而避光、脱落酸和茉莉酸甲酯可以降低该启动子的活性。

gutD基因的克隆及植物表达载体的构建

通过RT-PCR的方法从大肠杆菌K12中扩增出了gutD基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD18 T-vector中,序列分析表明克隆的片段长度为780bp,包含了完整的gutD基因的编码序列,除编码区第61位密码子由CTG变为CGT和第72位密码子CTT变为CCT其它序列与所报道的修正序列一致。以BamHⅠ和HindIII限制性内切酶从克隆载体上切取gutD基因,将其连接在相应酶切的中间载体KS上,再以KpnI和BamHI酶切重组子获得具粘性末端的目的片段(gutD)与植物表达载体pCAMBIA2300连接,重组质粒通过双酶切和PCR鉴定正确后,采用直接转化法将pCAMBIA2300-gutD质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并用PCR方法进行了鉴定。

苯并(a)芘对雄性小鼠生殖细胞毒性作用

目的研究不同剂量苯并(a)芘对小鼠睾丸细胞酶活性、精子畸变率及生殖细胞DNA损伤影响。方法采用分光光度法测定小鼠睾丸细胞乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)和山梨醇脱氢酶(SDH)活性;利用单细胞凝胶电泳检测苯并(a)芘对生殖细胞DNA作用;采用精子畸变和微核试验方法检测精子畸变率和精细胞微核率。结果随着染毒剂量增加,LDH活性逐渐降低,20 mg/kg苯并(a)芘组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);不同剂量苯并(a)芘均可造成小鼠生殖细胞DNA损伤,5,10,20 mg/kg的损伤率分别为44%,79%和88%,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),精子畸变率和精细胞微核率分别为1.10%,2.24%,3.64%和11.00%,14.40%,17.40%;与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论一定剂量条件下,苯并(a)芘能够影响小鼠睾丸细胞酶活性,导致小鼠生殖细胞DNA损伤,并在一定剂量范围内对雄性小鼠的生殖细胞产生毒作用。