谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰基转移酶抑制剂细胞筛选模型的建立

目的 建立己糖胺途径的关键酶谷氨酰胺∶6 磷酸果糖酰基转移酶(glutamine∶fructose 6 phosphateamidotransferase,GFAT)抑制剂的细胞筛选模型。方法 用改进的GDH法测定GFAT的活性。以速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取观察细胞对胰岛素的反应性;用长效胰岛素诱导HIRc细胞,形成己糖胺途径过度活跃和胰岛素抵抗的细胞模型,并应用该细胞模型和GDH法筛选GFAT抑制剂。结果 用25nmol·L-1长效胰岛素刺激HIRc细胞36h,可明显激活己糖胺途径,使GFAT活性上升47%;同时产生胰岛素抵抗,使速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取能力降低21%。Azaserine可明显抑制该模型中GFAT的活性。结论 长效胰岛素既可过度激活HIRc细胞己糖胺途径,又可使其产生胰岛素抵抗。该模型可用于筛选GFAT抑制剂。

6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4对卵巢癌细胞干性的影响及其机制

目的:探讨6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4(PFKFB4)对卵巢癌细胞干性的影响及其机制。方法:利用慢病毒系统构建PFKFB4过表达的卵巢癌SKOV3和A2780稳定细胞系。采用Real-time PCR和Western blot检测干性相关转录因子SOX2、OCT4和NANOG的表达,成球实验检测细胞的成球能力,确定PFKFB4对卵巢癌细胞干性的影响;利用自噬激活剂雷帕霉素处理卵巢癌细胞,检测SOX2、OCT4和NANOG的表达及细胞的成球能力,评估自噬对卵巢癌细胞干性的影响;Western blot检测自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ和p62的表达,确定PFKFB4对卵巢癌细胞自噬的影响;生物信息学分析卵巢癌中PFKFB4与BNIP3表达的相关性;Real-time PCR和Western blot检测PFKFB4对BNIP3表达的影响。结果:过表达PFKFB4促进SOX2、OCT4和NANOG的表达和卵巢癌细胞的成球能力;雷帕霉素刺激增加SOX2、OCT4和NANOG的表达和卵巢癌细胞的成球能力;过表达PFKFB4增加卵巢细胞自噬水平,包括增加LC3B-Ⅱ蛋白表达、降低p62蛋白表达;生物信息学分析显示,卵巢癌组织中PFKFB4与BNIP3表达高度正相关;过表达PFKFB4增加BNIP3的mRNA和蛋白水平。结论:PFKFB4可能通过激活BNIP3介导的细胞自噬增强卵巢癌细胞的干性。

拟南芥和油菜3-磷酸甘油酰基转移酶的关键活性位点鉴定

【目的】3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)催化三酰甘油(TAG)生物合成途径中的第1步酰化反应,TAG合成能力是油料作物的关键性状,但亦与人类肥胖症密切相关,了解GPAT结构与功能的内在关系对于这一性状的遗传或化学遗传调控至关重要。本研究旨在鉴定调控植物GPAT活性的关键氨基酸位点。【方法】运用定点突变技术构建了58个GPAT9突变基因,结合GPAT特异的酵母遗传互补法,剖析单一和多个氨基酸位点改变对GPAT9酶活性的影响。【结果】通过对拟南芥Arabidopsis thaliana AtGPAT9和油菜Brassica napus BnGPAT9的19个氨基酸残基进行分析发现:AtGPAT9的N端6个磷酸化位点的单独突变(T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和S31A)不能增强AtGPAT9在酵母异源表达时的活性。相反,其他6个位于酰基转移酶保守结构域外的氨基酸残基(85、114、119、230、237、322位)的改变能够显著影响GPAT9酶活性。发现这些氨基酸残基之间存在交互作用,例如,3个位点同时突变(Y85W/N119H/S237N)能使AtGPAT9活性大幅上升,加速酵母的生长并促进TAG的合成,表达这一突变酶的酵母中的TAG含量比表达野生型BnGPAT9的增加了45.7%。更值得注意的是,在114和237位磷酸化氨基酸残基对酰基转移酶活性产生负面效应,暗示植物GPAT9活性可能受磷酸化和非磷酸化机制调节。【结论】本研究获得了6个未经报道的关键GPAT酶活性调控位点,其中W85和H119是GPAT9正常功能所必需的,而L114、D230、N237和A322有利于维持GPAT9活性。

玉米甘油-3-磷酸酰基转移酶基因ZmGPAT13生物信息学及表达特性分析

【目的】对玉米(Zea mays L.)甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)家族成员ZmGPAT13进行生物信息学分析和在不同非生物胁迫处理下的基因表达模式变化检测,为进一步研究ZmGPAT13的生物学功能奠定理论基础。【方法】通过TAIR和MaizeGDB数据库获得拟南芥(Arabidopsis thaliana)和玉米中GPAT家族蛋白序列,利用生物信息学方法进行理化性质、蛋白结构、亚细胞定位、保守基序、系统进化、磷酸化位点和启动子顺式作用元件等分析,并采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对ZmGPAT13在不同组织部位及甘露醇(Mannitol)、NaCl、脱落酸(ABA)、高温(42℃)、低温(4℃)处理下的相对基因表达量进行分析。【结果】ZmGPAT13是一个定位于线粒体的跨膜蛋白,与部分GPAT家族成员含有排序相同的15个保守基序(motif),且与拟南芥中AtGPAT1的亲缘关系最近;预测分析发现ZmGPAT13含有62个磷酸化位点,可能与玉米中多个GPATs存在相互作用关系;ZmGPAT13基因启动子富含多种与低温和ABA响应等相关的顺式作用元件。通过qRT-PCR技术对ZmGPAT13组织表达模式分析发现ZmGPAT13的相对基因表达量在胚芽鞘(Coleoptile)中最高,根(Root)中次之,叶片(Leaf)中最低;甘露醇(Mannitol)、NaCl、脱落酸(ABA)及高温(42℃)和低温(4℃)处理均能诱导ZmGPAT13的基因表达显著上调。【结论】玉米中ZmGPAT13具有高度的进化保守性,可能通过转录水平的变化参与调控玉米对干旱、盐、高温和低温等非生物胁迫的响应过程。

利用柞蚕核型多角体病毒表达系统表达谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶

谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径(HBP)中的限速酶,与蛋白质糖基化修饰密切相关。本研究克隆的柞蚕GFAT基因(ApGFAT)CDS由2 022个碱基构成,编码674个氨基酸。将该基因连接到柞蚕杆状病毒转移载体pApM748BE后与ApNPV-Δph/egfp+共转染Tn-High Five细胞获得重组病毒。将重组病毒注射到柞蚕蛹体内,收集发病蛹血淋巴,用镍离子螯合柱纯化得到纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测表明,ApGFAT蛋白在柞蚕蛹体内得到成功表达,酶活力为0.978μmol/(min·mg)。

人谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺转移酶的体外表达、纯化及活性检测

目的:制备重组谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰胺转移酶(GFAT),检测其活性。方法:利用RT-PCR扩增人肝脏cDNA中GFAT1基因全长片段,克隆到表达载体pET32b中;在大肠杆菌Origami(DE3)中诱导表达,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组GFAT1;用体外酶学的方法检测GFAT的活性。结果:构建了pET32b-GFAT1质粒,经诱导表达及纯化,得到具有一定生物活性的GFAT。结论:利用原核表达系统可得到具有良好生物学活性的重组人GFAT1。

松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆与表达

谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase,GFAT)是己糖胺通路(HBP)的限速酶,参与几丁质的合成和蛋白质的糖基化。本研究利用RACE克隆了松墨天牛GFAT基因(Ma GFAT),Gen Bank登录号为KT362367,其长度为2624 bp,开放阅读框为2061 bp,编码686个氨基酸。序列对比分析显示Ma GFAT与赤拟谷盗相似性最高,为88%,在系统发育树上位于同一分支。采用RT-q PCR方法检测Ma GFAT在松墨天牛不同组织及不同发育时期的表达情况,结果表明:Ma GFAT在各虫态中,成虫中的表达量最高;在成虫部位中,翅的表达量最高;在幼虫各组织中,体壁的表达量最高。本文为研究GFAT结构与功能的关糸奠定基础,为阐明GFAT在松墨天牛几丁质合成中的作用提供参考。

玉米果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因的全长cDNA克隆及表达

以来自“掖单 4号”的玉米果糖 6 磷酸 ,2 激酶 果糖 2 ,6 二磷酸酶 (F2KP)基因cDNA片段 (AF0 0 75 82 )为基础 ,运用RT PCR和RACE技术 ,从“紫玉糯 1号”中获得了 1个 2 4 6 9bp的玉米F2KP基因cDNA克隆 ,命名为mF2KP ,GenBank登录号为AF33414 3。该cDNA包含 1个 2 2 2 6bp的开放阅读框 ,编码 74 1个氨基酸。序列分析表明 ,两个玉米品种的F2KP基因存在一定差异 :mF2KP基因的 3′端非编码区比AF0 0 75 82序列短 38bp ;在mF2KP的15 92、15 93和 16 0 5位置上 ,分别比AF0 0 75 82序列多出了 1个碱基 ,导致阅读框在一个小范围内发生了移位。North ern杂交表明 :不同玉米组织中mF2KP的表达差异明显。在茎中mF2KP的表达水平比叶片、苞叶以及雄花序中的表达水平低 ,但比未成熟种子中的表达水平高。在未成熟种子中 。

高温胁迫下转甜椒正义甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)烟草缓解PSⅡ光抑制

【目的】探讨类囊体膜脂组成与高温光抑制的关系。【方法】以转甜椒正义甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)的烟草植株为试验材料,测定了类囊体膜脂组成,高温胁迫后的光合参数和叶绿素荧光参数。【结果】转基因烟草植株类囊体膜的单半乳糖甘油二脂(MGDG),双半乳糖甘油二脂(DGDG),硫代异鼠李糖甘油二脂(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)的饱和程度均上升,其中MGDG饱和程度增加了16.2%,上升幅度最为显著。随胁迫温度的升高,转基因烟草植株与野生型植株Fv/Fm,ΦPSⅡ和Pn逐渐下降,但转基因植株下降幅度小于野生型,48℃时差异最为显著。【结论】转基因烟草植株类囊体膜脂脂肪酸饱和度增加,提高了PSⅡ热稳定性,缓解了PSⅡ光抑制。

冷诱导下毛百合甘油-3-磷酸酰基转移酶活性变化及其基因保守区的克隆

探讨了野生毛百合甘油-3-磷酸酰基转移酶活性在冷胁迫下的变化,用简并引物扩增了甘油-3-磷酸酰基转移酶基因保守区序列的结果表明,该保守区段长744 bp,推测编码247个氨基酸。在GPAT氨基酸序列中存在1个高度保守的区域(WIAPSGGRDRP),在NCBI上经过BLASTp比对分析,发现这段保守区序列为LPLAT基因超级家族酶类的催化活性区,此家族多为催化酰基辅酶A(acylCoAs)或者酰基载体蛋白(acylACPs)中的酰基与受体蛋白结合的酰基转移酶类。此序列Genbank登录号为HQ654523。

甘蔗果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析

以高等植物玉米、水稻的果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶(F2KP)的保守区域设计引物,并采用逆转录——聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从甘蔗叶片中扩增F2KP的cDNA片段,命名为SoF2KP-L.该cDNA片段长2 178 bp,含2 085 bp的完整开放阅读框,编码694个氨基酸.序列分析表明,甘蔗F2KP与其它已知的高等植物F2KP具有很高的同源性.

飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的特性及生物学功能

【目的】研究飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶(glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase,GNA)的特性及生物学功能,为探讨飞蝗表皮几丁质的合成机制及研发新型绿色环保杀虫剂提供实验依据。【方法】采用生物信息学方法,在飞蝗EST数据库中搜索GNA的cDNA序列,并与其它物种GNA序列进行同源比较;设计飞蝗GNA特异性表达引物,分析5龄第2天不同组织样品间的表达差异及5龄第1天至第7天表皮中GNA表达量的变化;构建pET-28a(+)蛋白表达载体,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中表达GNA重组蛋白,Ni柱亲和纯化重组蛋白并分析重组蛋白的酶学活性;通过RNA干扰研究GNA的生物学功能。【结果】飞蝗GNA与其它物种GNA的氨基酸序列一致性很高,结合底物GlcN6P的氨基酸残基完全一致,说明不同物种间GNA非常保守;飞蝗GNA组织特异性分析显示其在表皮、脂肪体及肌肉中表达量较高;飞蝗5龄表皮的发育变化表明,GNA在刚蜕皮后的表达量最高,之后逐步降低;飞蝗GNA重组蛋白在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中成功表达,经过Ni-NTA柱纯化得到单一目的条带,酶学特性研究表明飞蝗GNA重组蛋白的最适反应温度为37—50℃,最适pH为8.0—9.5;测定了飞蝗重组GNA的Km值,当D-GlcN6P的浓度为200μmol.L-1时,Acetyl-CoA的Km=133.60μmol.L-1;当Acetyl-CoA的浓度为200μmol.L-1时,D-GlcN6P的Km=42.43μmol.L-1;飞蝗GNA的RNA干扰结果显示,GNA的表达能够被有效沉默,但蜕皮及发育未受影响。【结论】飞蝗GNA与其它物种的GNA氨基酸序列一致性很高;用该序列原核表达的重组蛋白具有葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的活性;飞蝗GNA被干扰后未观察到对飞蝗蜕皮及发育产生影响,推测存在N-乙酰葡萄糖胺激酶(GlcNAc kinase)补救途径催化产生GNA的底物N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc6P),用于几丁质的合成。

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPATs)的研究进展

甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferases,GPATs)催化甘油三酯和甘油磷脂合成的第一步反应。目前在哺乳动物已发现四种亚型GPAT1-4,其中GPAT1和GPAT2定位于线粒体外膜,而GPAT3和GPAT4定位于内质网。GPATs在调节细胞甘油三酯和磷脂含量中起着重要的作用。基因过表达和敲除实验证实GPATs在肝脏脂肪变性、胰岛素抵抗和肥胖的发生发展过程中起着重要作用,并且部分亚型影响泌乳、精子发生等过程。本文将就GPATs各亚型的功能特点进行综述。

花生甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆与序列分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的功能及作用机理在模式植物拟南芥中已经得到了较为充分的研究,但是在花生中还没有关于这类基因的报道,其功能也没有得到证实。本研究通过Bioedit软件在花生cDNA文库中找到了6个可能编码GPAT蛋白的基因片段,其中有3个基因没有包含完整的开放阅读框。我们通过5'-和3'-RACE RT-PCR对这3个基因的全长进行了克隆,得到了包含完整读码框的基因序列,并将序列在GenBank上注册,同时对得到的序列进行了初步分析。

1，6-二磷酸果糖联合辅酶Q10治疗小儿病毒性心肌炎20例疗效观察

目的观察1，6-二磷酸果糖加辅酶Q10治疗小儿病毒性心肌炎的疗效。方法对1999年1月至2006年12月收治的小儿病毒性心肌炎患儿49例采用完全随机设计方法分成治疗组20例和对照组29例。治疗组给予1，6-二磷酸果糖100～250mg／（kg·d）静脉滴注，辅酶Q10 1～2mg／（kg·d）口服；对照组给予能量合剂静脉滴注，1次／d。10～14d为1个疗程，观察2组临床症状、心电图、心肌酶及心功能变化，并进行疗效评定。结果治疗组与对照组的总有效率分别为95．0％与72．4％，2组比较有统计学意义（P〈0．05）。结论1，6-二磷酸果糖加辅酶Q10治疗小儿病毒性心肌炎有较好疗效。

兵豆甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆和序列分析及蛋白质二级结构的预测

克隆了云南强抗冷性植物兵豆 (Lensculinaris)GPAT基因的编码区完整的cDNA片段 ,该片段长 1374bp ,编码 4 5 7个氨基酸残基。与豌豆 (Pisumsativum)、蚕豆 (Viciafaba)和长柔毛野豌豆 (Viciavillosa)相比较 (从剪切点起 ) ,氨基酸序列的同源性分别为 96 2 1%、95 6 6 %和 95 6 6 %。应用PSIPREDHFORMAT预测了这 4种植物GPAT酶的二级结构。

玉米果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因的结构与表达分析(英文)

通过RT_PCR ,结合RACE技术 ,得到了玉米 (ZeamaysL .)果糖_6_磷酸 ,2_激酶 /果糖_2 ,6_二磷酸酶的全长cDNA克隆 ,命名为mF2KP。氨基酸序列同源性比较发现 ,mF2KP蛋白可以分为两个部分 :C端包含高度保守的催化功能区 ,N端为植物中特有的多肽。将mF2KP基因中一段包含完整催化功能区的片段在大肠杆菌 (Escherichiacoli)中表达 ,融合蛋白具有果糖_6_磷酸 ,2_激酶 /果糖_2 ,6_二磷酸酶活性。Northern杂交证明在种子活力不同的幼苗中 ,mF2KP的转录水平存在明显差异。种子活力越高 ,幼苗中mF2KP的转录水平越低。

玉米6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因的克隆

以玉米Ｆ１减弱表达基因的ｃＤＮＡ片段为探针，从建立的玉米ｃＤＮＡ的文库中分离到相应的ｃＤＮＡ克隆．经测序和序列同源分析证明，该ｃＤＮＡ编码６－磷酸果糖－２－激酶／果糖－２，６－二磷酸酶，其氨基酸序列与人类、大鼠、牛和鸡等动物肝脏相同基因对应区段的相似性分为为６５．７％，６３．４％，６３．７％和６１．２％．

羽衣甘蓝甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

以羽衣甘蓝品种白孔雀为试验材料,通过同源克隆和RACE方法从低温诱导的羽衣甘蓝幼苗中分离得到了羽衣甘蓝甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)基因的全基因序列,采用生物学软件对该序列进行生物信息学分析。结果表明:该基因全长1558bp,推测其编码451个氨基酸,并命名为BaGPAT。序列分析发现,羽衣甘蓝BaGPAT基因推导的氨基酸与已知其他植物GPAT基因序列有54%～85%的相似性。聚类分析结果显示:羽衣甘蓝GPAT(BaGPAT)基因与拟南芥和宽叶独行菜GPAT基因亲缘关系较近。