6-磷酸山梨醇脱氢酶基因转化水稻(Oryza sativa L.)研究

以水稻品种秀水 1 1的幼胚为外植体 ,对影响愈伤组织诱导及植株再生的因素进行了研究 .结果表明 :MS+2 ,4- D 2 mg/L作培养基 ,愈伤组织诱导率达 1 0 0 % ,愈伤组织在 MS+6- BA2 mg/L+NAA 0 .1 mg/L的培养基上 ,分化频率高达 75.3% ;在此基础上利用基因枪转化技术 ,将外源的 6-磷酸山梨醇脱氢酶基因 (gut D)导入水稻基因组 ,转基因植株表现出对 Na Cl较强的耐性 .

6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutD)基因克隆、测序和表达

本研究根据6 磷酸山梨醇脱氢酶基因(gutD)两端序列设计引物,以假单胞杆菌(PseudonmonasXM)的总DNA为模板通过PCR的方法克隆gutD基因并进行序列分析.将克隆得到的gutD基因与原核表达载体pBV220连接并转化大肠杆菌(Es cherichiacoli)JM101后检测其蛋白表达及菌株生长耐盐性.

副干酪乳杆菌6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutF)基因的克隆和超表达

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶基因在乳酸菌中超表达的影响,本试验根据副干酪乳杆菌的基因序列设计引物,用PCR的方法扩增6-磷酸山梨醇脱氢酶(gutF)基因,将其连接到乳酸菌表达载体pMG36e,并将重组质粒转化到副干酪乳杆菌及乳酸乳球菌中获得重组菌株;对重组菌株表达产物进行蛋白质水平的电泳检测,检测出表达了大约28kD的蛋白;使用山梨醇替代培养基中的葡萄糖,以未转化基因菌株做阴性对照,进行生长曲线的测定,结果表明,转化菌株能够利用在以山梨醇作为碳源的条件下,重组菌株的生长速度和最终菌浓度均优越于对照菌株。本研究通过超表达6-磷酸山梨醇脱氢酶蛋白,对于进一步研究乳酸菌的耐受性具有十分重要的理论基础。

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子的转化及其转录活性

【目的】研究6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子(S6PDHp)的组织表达特点。【方法】利用Gateway技术构建了S6PDHp与GUS基因的融合表达载体,然后通过农杆菌介导法转化番茄"中蔬5号",对转基因植株进行PCR检测,对鉴定为阳性的植株进行GUS组织化学染色,验证S6PDHp的组织表达特性。【结果】将S6PDHp-GUS融合表达载体转化番茄,经PCR检测显示,成功获得了转S6PDHp基因的阳性番茄植株。对阳性植株各组织器官的GUS化学染色和活性检测结果显示,除叶片外许多器官都有很强的GUS活性,且在转基因番茄成熟期植株的茎部活性最高,根部活性最低;叶片从新叶到老叶的各个时期,GUS活性持续降低。【结论】S6PDHp表达在植物衰老过程中降低;且在转基因番茄茎部的GUS活性最强,说明该启动子具有组织表达特异性。

植物6-磷酸山梨醇脱氢酶

6-磷酸山梨醇脱氢酶是植物合成山梨醇的关键酶。文章从酶学特性、山梨醇转化、碳水化合物代谢等方面对6-磷酸山梨醇脱氢酶的研究进展以及此酶的某些应用研究情况作介绍。

1-磷酸甘露醇脱氢酶基因转化水稻的研究

PCR和 Southern blotting检测表明 ,来自大肠杆菌的 mtl D基因已通过农杆菌介导整合进水稻基因组。mtl D基因在 T1代出现分离 ,T2 代出现纯系。在 0 .75% Na Cl胁迫下 ,7个转基因 T3 代株系都能检测到 mtl D酶活性 ,与对照相比细胞膜的相对电导率和大分子渗漏值明显降低。部分转基因株系能在 1 .0 % Na Cl浓度下正常生长 ,而对照在 0 .5% Na Cl浓度下已不能存活。通过有性杂交途径实现了 mtl D和 gut D两个基因的聚合 ,部分杂交后代株系能在 1 .2 5% Na Cl胁迫下正常生长结实。

共转染小干扰RNA质粒联合抑制HeLa细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和转酮醇酶样基因-1表达

目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)及转酮醇酶样基因-1(transketolase like-1,TKTL-1)是肿瘤细胞磷酸戊糖代谢途径(pentose phosphate pathway,PPP)的2个重要关键调节酶。拟通过共转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体同时沉默人宫颈癌Hela G6PD及TKTL-1后,观察其对G6PD和TKTL1的联合抑制作用,旨在探讨共转染siRNA表达载体联合抑制PPP的效果及可行性。方法分别构建靶向G6PD和TKTL1基因siRNA干扰质粒载体,通过酶切和测序鉴定siRNA干扰质粒载体构建成功后,单独或共转染HeLa细胞株,RT-PCR检测G6PD、TKTL1 mRNA表达并结合G6PD、转酮醇酶(transketolase,TKT)活性测定判断并比较共转染联合抑制Hela细胞G6PD、TKTL1表达的效果。结果共转染靶向G6PD和TKTL1基因的siRNA干扰载体能显著下调G6PD和TKTL1基因表达水平[(0.96±0.05)vs(0.47±0.04),(0.98±0.05)vs(0.41±0.04),P<0.01]。同时,2个酶的活性也显著下降(99.2%vs34.5%和99.8%vs 40.1%,P<0.01)。共转染抑制G6PD基因mRNA表达较单独转染靶向G6PD基因的siRNA干扰载体的效果有显著下降[(0.47±0.04)vs(0.31±0.04),P<0.01)]。结论共转染siRNA干扰载体对人宫颈癌HeLa细胞PPP代谢通路进行联合抑制是一种有效的实验方案。

生当归水煎液对血虚小鼠体重、脏器指数及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶含量的影响

分析生当归水煎液对乙酰苯肼及环磷酰胺致血虚模型小鼠体重、脏器指数及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶含量的影响,以探讨生当归水煎液的补血作用机制。将80只清洁级昆明小鼠随机分为4组,分别为正常对照组、模型组、阳性对照组、当归水煎液组,测定各组小鼠全血中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的含量,并测定体重、胸腺指数及脾指数。与正常组相比,模型组小鼠给药前后体重、胸腺指数、脾指数及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的含量均显著降低(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组和生当归水煎液组各项指标均显著升高(P<0.05)。结论:生当归水煎液对血虚小鼠具有一定的补血作用,其补血机制可能与提高血红蛋白的含量有关;同时,它还可能增强机体免疫机能。

一种新的全酶法测定1,5-脱水葡萄糖醇

目的建立一种测定血清中1,5-脱水葡萄糖醇(1,5-AG)的方法,辅助诊断糖尿病.方法经葡萄糖激酶(GK)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)偶联系统使血清中葡萄糖彻底转化为不与呋喃糖氧化酶(PROD)反应的6-磷酸葡萄糖酸内酯,以PROD氧化1,5-AG,生成1,5-脱水果糖和H2O2,后者用Trinders反应进行比色测定.结果该方法在550 μmol/L以内线性良好.高值(455.5 μmol/L)、中值(215.8 μmol/L)和低值(15.1 μmol/L)批内变异系数(CV)分别为0.61%、0.84%和1.70%,批间CV分别为1.12%、2.00%和2.70%.平均回收率为101.6%.本法与微柱法相关性良好(r=0.999 8).用本法对100名健康者测定1,5-AG水平为(161.9±40.2) μmol/L,呈正态分布.参考值范围((-x)±1.96s)为83.1～240.7 μmol/L,无性别、年龄差异.结论该法简便、快速、灵敏、准确和稳定,可用于糖尿病的及时诊断与监控,适合于各类实验室常规应用.

血清葡萄糖及1,5-脱水葡萄糖醇双项同测的建立

目的建立新全酶终点法同时测定血清中1，5-脱水葡萄糖醇（1，5-AG）和葡萄糖（Glu）。方法用葡萄糖激酶（GK）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）偶联系统使血清中Glu彻底转化为不与呋喃糖氧化酶（PROD）反应的6-磷酸葡萄糖酸内酯（6-PGA），以其吸光度变化计算出Glu浓度；以PROD氧化1，5-AG，生成1，5-脱水果糖和H2O2，用Trinders反应比色测定出1，5-AG的浓度。结果1，5-AG在550μmol／L（Y=0．001X＋0．0658，r=0．999）以内，Glu浓度在40mmol／L（Y=0．051X＋0．128，r=0．9989）以内线性良好。Glu和1，5-AG的平均批内变异系数（CV）分别为0．88％和1．05％，批间CV分别为1．40％和1．94％。Glu和1，5-AG的平均回收率分别为100．2％和101．6％。三酰甘油（TG）≤8．9mmol／L、血红蛋白（Hb）≤4g／L、总胆红素≤350μmol／L时不影响Glu和1，5-AG的测定。本法测定l，5-AG与Lana微柱法及GK法与HK法测定Glu相关性均良好（r^2=0．999）。Glu与1，5-AG的95％参考值范围分别为3．7—5．7mmol／L和83．1～240．7μmol／L。结论本法简便快速、灵敏、准确和稳定，可自动化双项同测Glu和1，5-AG，为糖尿病的检测与治疗监控提供了新的方法。

蔷薇科植物中山梨醇代谢酶的研究进展

蔷薇科植物中,与山梨醇代谢相关的酶主要有:6-磷酸山梨醇脱氢酶、山梨醇脱氢酶和山梨醇氧化酶。综述了近些年来国内外关于这几种酶的研究进展,涉及的内容有:酶的性质与作用、酶的活性变化与转录的关系,及其在生物技术方面的研究成果,并对今后的研究工作进行了展望。

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子逆境诱导表达特性研究

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因启动子(S6PDHp)的逆境诱导表达特性,利用Gateway技术构建了S6PDH基因启动子区5'端系列缺失体与GUS基因的融合表达载体,并通过农杆菌介导法转化拟南芥。对转基因拟南芥进行低温和外源ABA处理,通过GUS蛋白活性变化分析S6PDHp的逆境诱导表达特性。研究结果发现,通过Gateway技术构建了4个S6PDHp 5'端系列缺失体与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的融合表达载体(pGWB433-S6PDHp1、pGWB433-S6PDHp2、pGWB433-S6PDHp3和p GWB433-S6PDHp4)并获得了相应的转基因拟南芥。对转基因植株进行低温处理后发现,p GWB433-S6PDHp3转基因植株中的GUS活性增幅最大,达到显著水平,而其他转基因植株中的GUS活性基本保持不变。外源ABA处理后发现,除p GWB433-S6PDHp4外,其余启动子缺失体转基因拟南芥中GUS活性显著升高。以上结果表明,低温和外源ABA能够诱导S6PDHp的表达,但不同的缺失体响应程度不同,意味着在S6PDHp序列(-2 396bp至-236bp)中可能存在着响应逆境胁迫的正负调控顺式作用元件。

梨树山梨醇代谢及其调控因子研究进展

山梨醇是梨树等蔷薇科植物最主要的光合作用产物和碳水化合物转运形态。山梨醇代谢是梨树最重要的糖类生化过程之一,其不仅影响了果实内在品质的形成,而且也为营养物质合成提供了基础原料。本文综述了山梨醇合成、转运以及分解过程,重点介绍山梨醇代谢过程中主要相关酶（6-磷酸山梨醇脱氢酶和山梨醇脱氢酶）以及转运蛋白基因SOT在梨树中的研究进展,并对今后的研究工作进行了展望,以期为进一步深入研究山梨醇代谢机制和提高梨果品质提供参考。

比较硬膜外与静脉镇痛对开胸手术患者红细胞糖代谢限速酶和血浆葡萄糖及皮质醇的影响

目的:比较硬膜外与静脉镇痛对开胸手术患者红细胞磷酸果糖激酶(PFK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6PD)和醛糖还原酶(AR)的活性,以及血浆葡萄糖和皮质醇水平的影响。方法:42例食道癌手术患者随机分为Ⅰ、Ⅱ两组,每组21例。两组患者术中均行静脉全麻复合硬膜外阻滞,Ⅰ组术后行静脉芬太尼镇痛(15μg/kg),Ⅱ组术后行硬膜外镇痛(0.1250%罗哌卡因混合0.0002%芬太尼)。分别于麻醉前(T0)、手术60min(T1)、术后60min(T2)、术后1天晨(T3)和术后2天晨(T4)抽取肘静脉血,测定红细胞PFK、G-6PD和AR的活性及血浆葡萄糖和皮质醇的水平,采用视觉模拟评分(VAS)判定术后4、12、24、48h镇痛效果,比较术后镇痛(PCA)泵内芬太尼用量和按压次数。结果:①与T0相比,T3时Ⅰ组患者PFK活性显著降低(P<0.01),G-6PD和AR活性显著升高(P<0.01),Ⅱ组患者三个酶的活性无明显变化(P>0.05);此时两组之间相比较有显著性差异(P<0.05)。②两组患者血糖和皮质醇水平均自T1开始明显升高(P<0.05或P<0.01),至T3时达峰值(均P<0.01),T4时点Ⅱ组患者的血糖值恢复至术前水平(P>0.05);T3、T4时Ⅰ组血糖和皮质醇值均明显高于Ⅱ组(P<0.05或P<0.01)。③两组患者术后镇痛效果均良好,VAS镇痛评分<3分,但Ⅰ组患者术后12、24hVAS评分明显高于Ⅱ组(P<0.05),PCA的芬太尼用量和按压次数也明显高于Ⅱ组(P<0.01)。结论:食管癌手术患者采用硬膜外镇痛,可抑制血糖与皮质醇水平升高,减轻术后的应激反应,改善红细胞内糖代谢状况,其镇痛效果优于静脉镇痛。

磷酸戊糖途径的调节对红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响

在正常的红豆杉细胞悬浮培养过程 ,葡萄糖 - 6-磷酸脱氢酶 (G6PDH)活性的变化趋势与生物量的基本相似。而在chitosan处理的细胞中G6PDH活性升高而生物量下降。 1 0 0mg .L- 1 chitosan和 5 0 0mg .L- 1 chitosan均对细胞G6PDH具有诱导作用 ,且后者的诱导强度较前者的高。乙二醇双 2 氨基乙基醚四乙酸 (EGTA)的加入降低chitosan对细胞G6PDH的诱导程度 ,显示chitosan对G6PDH的诱导需要Ca2 +的参与。谷胱甘肽 (GHS)的处理可反馈抑制chitosan对细胞G6PDH的诱导。通过分析调节后G6PDH的各种活性与细胞中紫杉醇产量的关系 ,认为采用合适的处理方法调节磷酸戊糖途径 。

siRNA沉默转酮醇酶样蛋白1基因对人肝癌HepG2细胞生长微环境的影响

目的:通过siRNA技术沉默肝癌细胞系HepG2转酮醇酶样蛋白1(TKTL1)基因后观察其对生长微环境中乳酸生成水平、还原型谷胱甘肽(GSH)水平及NADPH/NADP+比值的影响,旨在探讨肿瘤细胞TKTL1表达与其转移特性的内在联系。方法:用构建的靶向TKTL1基因siRNA干扰质粒载体转染HepG2细胞株,RT-PCR检测TKTL1 mRNA表达并结合转酮醇酶(TKT)活性测定判断其干扰效率;以未转染HepG2细胞为对照,进一步观察TKTL1沉默的癌细胞内乳酸生成水平、GSH含量、NADPH/NADP+比值及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)活性的变化。结果:siRNA沉默HepG2细胞TKTL1基因后TKTL1 mRNA表达下降、TKT活性显著降低(P<0.01),乳酸生成、GSH水平及NADPH/NADP+比值较对照组细胞均显著降低(P<0.01),但G-6-PD活性无明显变化(P>0.05)。结论:肿瘤可能通过TKTL1高表达调整葡萄糖代谢从而改变乳酸及氧化自由基生成,使细胞生长微环境利于肿瘤转移。

靶向葡萄糖-6-磷酸脱氢酶对食管癌细胞细胞化疗耐药的影响及其机制

目的探讨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在食管癌细胞中表达水平及其对细胞化疗耐药的影响和分子机制。方法选取2021年1月至2022年3月河南省人民医院收集的65例食管癌标本和对应癌旁组织作为研究对象,采用蛋白质印迹法(Western blot)分析食管癌和癌旁组织G6PD表达水平;在人食管癌细胞株EC109细胞采用浓度梯度递增法建立紫杉醇耐药细胞株EC109/DOX,分别采用对照短发卡RNA(shRNA)和G6PD shRNA慢病毒感染EC109/DOX细胞系,建立对照组和G6PD KD组;采用G6PD抑制剂处理24 h后。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)分析不同处理的细胞增殖能力;采用流式细胞术分析不同处理细胞的耐药能力。采用Western blot分析不同处理对谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)表达水平的影响。组间比较采用t检验。结果癌旁组织中G6PD表达水平(0.97±0.16)明显低于食管癌组织中G6PD蛋白表达水平(2.34±0.28),差异有统计学意义(t=32.670,P<0.05)。紫杉醇耐药组患者G6PD蛋白表达水平(2.14±0.16)明显高于紫杉醇化疗敏感组患者G6PD蛋白表达水平(2.56±0.22),差异有统计学意义(t=8.280,P<0.05)。EC109细胞G6PD蛋白表达水平(0.95±0.07)明显低于EC109/DOX细胞G6PD蛋白表达水平(2.21±0.23),差异有统计学意义(t=11.870,P<0.05)。对照组细胞紫杉醇处理24 h和48 h后吸光度值(1.25±0.03、1.98±0.08)明显高于G6PD KD组细胞24 h和48 h吸光度值(0.87±0.02、1.42±0.07),差异有统计学意义(t=21.631、12.571,P<0.05)。对照组细胞紫杉醇处理48 h后凋亡比例[(12.94±1.78)%]明显低于G6PD KD组细胞凋亡比例[(34.56±4.03)%],差异有统计学意义(t=10.961,P<0.05)。紫杉醇处理的EC109/DOX细胞凋亡水平[(12.83±2.25)%]明显低于6-AN和紫杉醇共处理的EC109/DOX细胞凋亡水平[(43.36±4.53)%],差异有统计学意义(t=13.500,P<0.05)。紫杉醇处理对照组和G6PD KD组细胞48 h后,对照组细胞GSTP1蛋白表达水平(12.94±1.78)明显高于G6PD KD组细胞(34.56±4.03),差异有统计学意义(t=6.490,P<0.05)。紫杉醇处理的EC109/DOX细胞GSTP1蛋白表达水平(1.97±0.05)明显高于6-AN和紫杉醇共处理的EC109/DOX细胞GSTP1蛋白表达水平(1.17±0.14),差异有统计学意义(t=12.260,P<0.05)。结论葡萄糖-6-磷酸脱氢酶通过调节GSTP1蛋白表达水平,进而调控着食管癌细胞对紫杉醇耐药性。

液体型吡喃糖氧化酶法试剂测定血清1,5-脱水葡糖醇

1，5-脱水葡萄糖醇（1，5-AG），又名2-脱氧葡萄糖、1，5-脱水山梨醇。临床资料表明，血清1，5-AG的监测可确切地反映较短期内糖尿病的控制程度，是糖尿病监护中的良好指标，

红豆杉细胞中的酚类化合物含量与紫杉醇产量之间的关系

研究了在真菌诱导子诱导红豆杉细胞时酚类化合物与紫杉醇产量之间的关系。结果表明:真菌诱导子处理提高了细胞的G6PD、PAL的活性和酚类化合物含量;真菌诱导子和谷氨酸的联合处理也可提高细胞中G6PD、PAL的活性,且联合处理后的酶活性较真菌诱导子单独处理的要高。联合处理后紫杉醇产量与酚类化合物的变化相似,均是前期低于真菌诱导子处理,后期高于诱导子处理;PAL的抑制剂AOA显著降低真菌诱导子处理的酚类化合物和紫杉醇的产量,同时细胞死亡明显增加。因此认为,酚类化合物与细胞诱导时的紫杉醇产量有关,细胞诱导时保持一定浓度的酚类化合物有利于紫杉醇产量的提高。

苹果S6PDH基因克隆与原核表达

6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)是蔷薇科植物中合成山梨醇的重要酶。以苹果叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到S6PDHcDNA全长,将其与大肠杆菌表达载体pET-32a(+)构建原核表达载体pET-S并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测结果表明该基因表达了1个约54kD的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了试验基础。