大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达

通过PCR克隆了大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因manA,分别构建了含manA基因的原核和真核生物表达载体。在大肠杆菌中经IPTG诱导表达的GST-PMI融合蛋白,经亲和层析纯化和PreScission蛋白酶酶切,SDS-PAGE分析证实PMI蛋白为42 ku。对转manA基因的拟南芥进行PCR分析表明,manA基因已稳定整合到拟南芥基因组中。氯酚红显色反应证实,整合到拟南芥基因组中的manA基因能表达具有6-磷酸甘露糖异构酶活性的PMI蛋白。这些结果说明,克隆的manA基因可在细菌和高等植物中高效表达。

金龟子绿僵菌甘露糖6-磷酸异构酶基因cDNA序列的克隆及分析

通过绿僵菌属甘露糖6-磷酸异构酶基因保守核苷酸区域设计简并性引物,采用RT-PCR及RACE-PCR技术成功克隆了金龟子绿僵菌mpi基因cDNA序列。该基因cDNA序列全长为1 513 bp,开放阅读框长度为1 328 bp,共编码441氨基酸。BLAST分析发现该基因演绎的氨基酸序列与其它真菌同源性较高,蛋白结构分析表明MPI蛋白是较保守的蛋白磷酸酶结构特征,主要由α螺旋和不规则卷曲构成。

金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因的克隆与表达

目的对金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因(APE)进行克隆、鉴定与表达,为新型抗菌药物的设计提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增APE基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建表达APE的重组质粒,将重组质粒先转化大肠杆菌TG1内并提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后再转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果构建了表达载体pET-32a(+)-APE,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导时获得表达,表达的蛋白质相对分子质量为45.2×10~3。结论 APE基因成功克隆到表达质粒内并获得了表达。

一种源于枯草芽孢杆菌的新型甘露糖-6-磷酸异构酶的基因克隆与表达

通过PCR克隆了一种来自枯草芽孢杆菌str. 168菌株的甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因(BSMPI-2),利用p ET-28a载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经IPTG诱导实现了BSMPI-2蛋白的表达,经过亲和层析纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证,证实目的蛋白分子量约3. 54×10~4,BSMPI-2以L-核糖为底物时的最适反应条件为pH 8. 0、60℃、外源添加0. 5 mmol/L Co^(2+),该酶催化2 h可将29%的L-核糖异构为L-核酮糖。

芹菜中6-磷酸甘露糖还原酶基因的克隆、进化和表达分析

以2个芹菜品种‘津南实芹’和‘美国西芹’为试材,采用RT-PCR技术分别获得6-磷酸甘露糖还原酶(M6PR)cDNA序列。序列分析表明:来源于2个芹菜品种的6-磷酸甘露糖还原酶基因核苷酸序列全长均为930 bp,编码309个氨基酸;预测其蛋白质相对分子质量为35×103,pI值为6.38。空间结构分析显示:M6PR蛋白由11个α-螺旋和13条β-延伸主链组成,中间形成1个疏水穴;催化四分体(Asp、Tyr、Lys和His)分布于疏水穴内部,具有催化活性。进化分析显示:芹菜M6PR与卷柏、小立碗藓、云杉等远古物种的醛-酮还原酶(AKR)相似性较高。实时定量PCR表达分析表明:M6PR基因主要在芹菜的茎中表达,具有明显的组织特异性。

新型筛选标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因植物中的应用

广泛应用于植物遗传转化的抗生素和除草剂选择标记对环境生态和人类健康可能具有潜在风险,因此生物安全筛选标记已成为当前植物转基因研究的热点。磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)是一种新型生物安全选择标记基因,全面介绍了其作用原理、生物安全性、在植物转化中的应用与检测等,深入分析了其在植物转化中作为筛选标记存在的问题与不足,并就其发展前景进行了展望,以期为在转基因植物中的广泛应用奠定基础。

PMI/甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用

介绍了一种可在植物转基因中应用的新型筛选方法———磷酸甘露糖异构酶(PMI)法,与传统筛选体系不同,它以甘露糖为筛选剂对转化细胞进行正筛选。PMI能将甘露糖- 6 -磷酸转化成果糖- 6 -磷酸,使转化细胞以甘露糖为唯一或主要碳源而正常生长;非转化细胞由于不能利用甘露糖而停止生长。该筛选体系受基因型、培养基中其他糖和磷酸根离子浓度及培养条件等因素的影响。目前已应用于多种模式植物和经济作物的转基因筛选,在木本植物甜橙上也首获成功。其检测方法多样,除了常规转基因检测方法外,还可对酶活性进行检测,其中氯酚红法简单可靠,且无需昂贵试剂。安全评估结果表明PMI基因对人体健康和环境无害。PMI/甘露糖筛选体系有望成为植物转基因的又一有效筛选手段。

水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系的建立

根据genebank中公布的pmi基因序列设计引物,通过PCR扩增从大肠杆菌中分离出6-磷酸甘露糖异构酶基因。将该基因替换植物表达载体pCAMBIA1300中的潮霉素抗性基因hpt,构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI。对水稻进行了基因枪转化和农杆菌转化,研究了筛选培养基中甘露糖浓度对抗性愈伤组织频率的影响。部分抗性愈伤组织已获得再生植株,PCR检测初步证明外源基因已转入植物细胞。

L-核糖的生产研究进展

L-核糖是合成许多抗病毒药物的关键中间体,自然界和生物体中并不存在。L-核糖的制备方法有化学合成法和生物合成法。与化学合成法相比,生物合成法对环境更加有利。生物合成法是应用微生物及其酶以核糖醇或L-阿拉伯糖为原料生产L-核糖。综述了L-核糖的制备方法以及产品的分离纯化技术,并对L-核糖的研究现状和前景进行了展望。

甘露糖阳性选择系统在水稻遗传转化中的应用研究进展

甘露糖阳性选择系统是近几年应用较多的一种植物转基因安全筛选体系,该体系是以大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因pmi为筛选标记基因,D-甘露糖为筛选剂进行筛选。本文简要综述了甘露糖阳性选择系统在水稻转基因研究中的应用情况。

以PMI为选择标记基因的雪柑遗传转化体系的优化

[目的]以PMI为选择标记基因对雪柑的遗传转化体系进行优化。[方法]对农杆菌的菌液浓度、实生苗培养条件、甘露糖筛选压、2,4-D浓度、2,4-D预处理时间、农杆菌侵染时间、共培养时间进行梯度试验来研究转化后的再生率,并对筛选培养基中6-BA和NAA不同浓度组合进行试验来研究抗性大苗的筛选。[结果]经过暗培养20 d光培养10 d条件的实生苗外植体在农杆菌菌液OD600为0.6,1.0 mg/L 2,4-D预处理3 h,农杆菌侵染30 min,共培养时间4 d,筛选压为甘露糖20 g/L的情况下转化后的再生率大大提高,而在筛选培养基中加入2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA有助于抗性大苗的筛选。[结论]通过对影响转化的各种因素的优化试验建立了雪柑以PMI基因/甘露糖选择标记系统的高效遗传转化体系。

甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用

为了研究甘露糖正向筛选体系在拟南芥转化中的有效性,本研究参照GenBank上公布的PMI基因序列,通过PCR从大肠杆菌克隆了6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase,PMI)基因,替换植物表达载体pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase,HPT)基因,并将以CaMV35S和AmCBL1P两种启动子调控的沙冬青AmCBL1基因成功地构建到重组载体pPMI上,并导入根癌农杆菌E-HA105中,然后通过农杆菌花序浸染法转入拟南芥。将获得的阳性植株通过GUS组织化学法鉴定、氯酚红(chlorophenol red,CPR)法及PCR检测,证明PMI基因已经转入拟南芥中。在不使用抗生素和除草剂的情况下这种筛选体系为转基因拟南芥筛选提供了更加安全有效的方法,并且为以后AmCBL1基因的功能验证及植物抗逆性的改良奠定了基础。

甘露糖对乳癌细胞增殖及表柔比星化疗敏感度影响

目的探讨甘露糖对乳癌细胞增殖及表柔比星(EPI)化疗敏感性的影响。方法免疫印迹法测定乳癌细胞(BT-549、HCC1937、T-47D、MCF-7)和正常乳腺细胞(MCF-10A细胞)代谢甘露糖的关键蛋白磷酸甘露糖异构酶(MPI)的表达。将MCF-7和T-47D细胞随机分为对照组(含体积分数0.10胎牛血清的普通培养液)、甘露糖组(25 mmol/L甘露糖)、葡萄糖组(25 mmol/L葡萄糖)、EPI组(1μmol/L EPI)、甘露糖联合EPI组(1μmol/L EPI+25 mmol/L甘露糖)和葡萄糖联合EPI组(1μmol/L EPI+25 mmol/L葡萄糖),各组分别加入含相应药物培养液,于有氧条件和乏氧条件下培养,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定甘露糖及甘露糖联合EPI对细胞生长活性的影响,免疫印迹法检测对照组、甘露糖及葡萄糖组T-47D细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax和Bcl-2的表达。结果 MCF-10A、BT-549、HCC1937、T-47D和MCF-7细胞中MPI表达差异有统计学意义(F=392.680,P<0.05)。与MCF-10A细胞相比,T-47D细胞MPI表达量相对较低,MCF-7细胞表达相对较高,差异有统计学意义(t=25.449、32.857,P<0.05)。有氧条件下,甘露糖组T-47D细胞增殖率较对照组明显降低(t=33.338,P<0.05),MCF-7细胞增殖率与对照组比较差异无显著性(P>0.05);甘露糖联合EPI组T-47D细胞增殖率显著低于EPI单药组,差异有统计学意义(t=22.901,P<0.05);甘露糖联合EPI组与对照组相比MCF-7细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。乏氧条件下,甘露糖组T-47D细胞和MCF-7细胞增殖率较对照组显著降低(t=24.538、35.158,P<0.05),甘露糖联合EPI组T-47D和MCF-7细胞增殖率低于EPI单药组(t=37.986、54.622,P<0.05)。与空白对照组相比较,各加药组T-47D细胞Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2蛋白表达差异无显著性(P>0.05)。结论甘露糖能抑制乳癌细胞增殖,并增加乳癌细胞对EPI敏感性,MPI表达较低的乳癌细胞对甘露糖更敏感。

根癌农杆菌介导gna基因对水稻的转化

褐飞虱在中国分布很广,近年来已成为南方稻区的主要害虫。大量研究表明,进行抗虫基因分子育种是迅速改良水稻褐飞虱抗性的有效途径。采用农杆菌介导法将来源于大肠杆菌的6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)安全选择标记基因和)花莲凝集素(GNA)抗虫基因构建于同一表达载体上进行遗传转化,获得带有安全标记基因的抗褐飞虱转基因植株。通过PCR扩增、Southern印迹和GUS检测分析表明,PMI标记基因和抗虫GNA基因同时被转入部分植株中并得到了表达,其外缘基因主要以单拷贝的方式插入水稻基因组中。对随机选取的8个转基因单株T0代种子经含潮霉素的培养基培养15d后抗感苗数统计分析表明,绝大多数转基因植株后代符合单基因的遗传分离规律。

转基因植物生物安全标记基因

在大量转基因植物被推向市场的同时 ,人们对转基因植物对环境及人类健康等许多方面可能存在的风险感到担扰。标记基因的生物安全性成为人们普遍关注的问题之一。新的标记基因不仅要求能够对转基因植物进行筛选和鉴定 ,而且必须对环境和生物都是安全的。概述并评价了绿色荧光蛋白基因、核糖醇操纵子、6 磷酸甘露糖异构酶基因、木糖异构酶基因以及谷氨酸 1

利用转基因番茄表达人成纤维细胞生长因子21(FGF21)

【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblast growth factor-21,FGF21),为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因(pmi)作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体pCAMBIA1390RⅡ(简写为p1390RⅡ)上,构建重组表达质粒p1390 RⅡMFGF21。采用冻融法将质粒p1390RⅡMFGF21转入根瘤农杆菌EHA105,叶盘法转化番茄(Lycopersicon esculentum)"中蔬6号",采用PCR检测、Southern杂交筛选转基因番茄阳性植株,并对FGF21蛋白在转基因番茄叶片中的表达进行了Western blot分析。【结果】成功构建了带pmi安全选择标记基因的植物双元表达载体p1390RⅡMFGF21,在番茄中初步建立了以pmi为选择标记基因的遗传转化体系,共获得了26株转基因番茄植株,其中5株为阳性克隆,转化率为19.2%。采用PCR扩增和Southern blot分析进行检测,结果表明,重组fgf21基因已整合到转基因番茄基因组中。Western blot分析检测结果显示,FGF21蛋白在转基因番茄叶片中有一定水平的表达,并具有良好的抗原性。【结论】获得了以pmi为选择标记成功表达FGF21蛋白的转基因番茄遗传体系。

碳源对manA基因突变大肠杆菌代谢的影响

ManA基因编码的甘露糖-6-磷酸异构酶在大肠杆菌中催化D-甘露糖和D-果糖的异构化,促进大肠杆菌对碳源的代谢吸收。本文通过研究manA基因突变大肠杆菌对碳源的利用和编码糖代谢基因情况,探讨甘露糖-6-磷酸异构酶对大肠杆菌糖代谢的影响。采用Ⅱ型内含子逆转录突变方法构建manA基因突变大肠杆菌,分析manA基因突变大肠杆菌对不同碳源的利用情况和manA基因突变对大肠杆菌糖代谢相关基因表达的影响,结果显示,大肠杆菌BL21(DE3)ΔmanA以甘露糖、果糖为碳源时,菌株生长受到显著抑制;以淀粉为碳源时,BL21(DE3)ΔmanA菌株的生长显著优于野生型大肠杆菌;以葡萄糖为碳源时,manA基因突变对大肠杆菌的生长无显著影响。通过基因表达分析,发现大肠杆菌BL21(DE3)ΔmanA中甘露糖代谢相关基因的表达显著性降低;果糖代谢途径中6-磷酸果糖激酶Ⅰ亚基的编码基因(pfkA)显著下调表达;水解淀粉的α-淀粉酶编码基因(malS)显著性上调表达。ManA基因突变影响大肠杆菌甘露糖、果糖和淀粉代谢途径中相关基因的表达,从而影响大肠杆菌对碳源的利用。

以PMI为选择标记的露地菊转Lc-14-3-3基因体系的建立及功能鉴定

从东北地区高pH盐碱地上生长良好的羊草中克隆Lc14-3-3基因,以露地菊(Chrysanthemum morifolium)‘火焰’叶片愈伤组织为受体,以农杆菌介导,将Lc14-3-3基因转入‘火焰’基因组中。以载体中的磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose isomerase,PMI)为筛选标记,通过甘露糖的筛选,结合PCR、Southern杂交检测Lc14-3-3整合到其基因组。通过转基因植株与对照植株的耐盐性对比可见转化Lc14-3-3基因植株具有更高的耐盐能力。磷酸甘露糖异构酶基因/甘露糖筛选系统可有效应用于露地菊遗传转化。

抗逆转录因子在百脉根中的功能分析

为提高豆科牧草百脉根抗旱方面的能力,从沙生植物胡杨和铃铛刺中克隆了4个抗逆转录因子基因并进行功能分析,从中筛选了2个具有抗旱特性的基因PeDREB2a和HhERF2,构建了以磷酸甘露糖异构酶为筛选标记的单、双价植物表达载体,转化百脉根Leo品种,结果表明,转录因子基因明显改善了百脉根的抗旱特性,经过抗旱复水试验证明转基因百脉根成活率达到100%。

PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及转化白花丹参体系的建立

目的:构建含有大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase,PMI)基因并替换潮霉素抗性(hygromycin,hyg)基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI,同时建立以PMI/甘露糖为筛选标记的白花丹参转基因体系。方法:首先从大肠杆菌Escherichia coli DH5α中克隆PMI基因,然后以PMI基因替换植物表达载体pCAMBIA1305中的hyg基因,构建了以PMI基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI,并用电击转化方法导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404中,用叶片浸染法转化白花丹参。结果:在白花丹参MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1固体分化培养基中附加20 g·L-1甘露糖和10 g·L-1蔗糖为碳源的选择压力下,pCAMBIA1305-PMI的转化率为23.7%,对再生植株用PCR检测证实了PMI基因的导入。结论:建立了以PMI-甘露糖为选择系统的白花丹参转基因体系,可应用于后续目的基因的转化奠定了基础。