1-甲基-2-苯基硫甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯的合成

以氯代乙酰乙酸乙酯和苯硫酚为主要原料,经硫醚化、胺化、Nenitzescu反应,合成目标产物1-甲基-2-苯基硫甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯,产品总收率为36 %.硫醚化反应在n（苯硫酚）：n（NaOH）：n（氯乙酰乙酸乙酯）=1：1：1,反应时间为3～4 h, 反应温度为5～10 ℃的条件下进行,中间产物4-苯硫基乙酰乙酸乙酯（I）的收率为92 %.胺化反应在n（甲胺）：n（I） =1.1：1,反应时间共为20 h的条件下反应,中间产物4-苯硫基-3-甲胺基-2-丁烯酸乙酯（II）收率为94 %.Nenitzescu反应在n（溴代对苯醌）：n（II） =1：1.1,反应时间为7～8 h,反应温度为80 ℃条件下反应,得到最终产物1-甲基-2-苯基硫甲基-6-溴-5-羟基吲哚-3-羧酸乙酯（Ⅲ）,收率为40 %.经红外光谱、核磁共振光谱及质谱鉴定,证明结构正确.

2-苯基-3-甲硫基-1H-吲哚的合成研究

目的合成2-苯基-3-甲硫基-1H-吲哚。方法以邻碘苯胺与苯乙炔为起始原料,通过Sonogashira交叉偶联反应、亲电环合反应合成了2-苯基-3-甲硫基-1H-吲哚。结果合成了2-苯基-3-甲硫基-1H-吲哚,反应总收率为80.6%。结论该反应条件温和,产物立体选择性好,收率较高,尤其是碘单质作用下的亲电环合反应,是在无金属条件进行的,产物结构经NMR和MS得到了确证。

CM-Dil与DAPI联合标记人羊膜上皮细胞的可行性研究

目的建立人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cell，HAEC）的体外培养方法，并探讨氯甲基苯甲酰胺（CM—Dil）与4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对HAEC进行联合标记示踪的可行性。方法运用酶消化法获取HAEC，收集第2代细胞，流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CIM5和CD105的表达率，SP免疫化学法鉴定HAEC。CM—Dil与DAPI对HAEC进行体外标记，荧光倒置显微镜下观察1d、7d和14d的标记情况，台盼蓝染色检测细胞活力，CCK-8法检测细胞增殖以明确联合标记对体外培养HAEC生长特性的影响。结果HAEC贴壁培养后呈扁平多角形，CD29、CD34、CD44、CD45和CD105的阳性率分别为99．64％、2．21％、32．41％、0．84％、36．70％，细胞角蛋白Keratin阳性表达。HAEC在cM—Dil和DAPI联合标记1d后，荧光显微镜下可观察到细胞膜和细胞核分别在不同波长下呈红色和蓝色荧光，标记率为100％；14d后，经传代培养的HAEC荧光强度与1d时相近，细胞形态无改变。台盼蓝染色显示标记细胞存活率为96．8％-98．9％，CCK-8检测标记细胞的增殖力较未标记组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论CM—Dil和DAPI可有效标记HAEC，染色简单、无细胞毒性，荧光衰减较慢，可作为HAEC的标记及示踪方法。

醋酸钯催化直接芳基化合成2-芳基吲哚类化合物

为探究操作简便、绿色经济、底物适用性强的合成2-苯基吲哚类化合物的新方法,对反应溶剂、催化剂种类及用量、氧化剂种类和反应温度等反应条件进行筛选,选取最佳反应条件对取代吲哚及取代苯硼酸进行底物适用性实验,并进行结构表征。实验得到以物质的量分数为10%的Pd(OAc)_(2)为催化剂,物质的量分数为20%的Cu(OAc)_(2)为氧化剂,冰乙酸为溶剂,室温反应8 h为最佳反应条件,共合成了23个2-芳基吲哚类化合物,产率高达87%。本实验开发了一步合成2-芳基吲哚类化合物的方法,该方法对不同取代的吲哚和苯硼酸均具有较好的适用性,与已报道的方法相比,本方法具有底物适用性强、产率高、操作简便、经济环保等优点,为2-芳基吲哚类化合物的制备提供了更加高效的路径。

Notch信号通路在血小板衍生生长因子-BB诱导人胰腺癌细胞增殖过程中的作用

目的探讨Notch信号通路在血小板衍生生长因子(PDGF)-BB诱导人胰腺癌细胞(HPAC)增殖过程中的作用。方法 MTT法检测PDGF-BB及γ-secretase抑制剂4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPT)对HPAC增殖活力的影响;Western blotting检测细胞Notch蛋白表达水平的变化;染色质免疫共沉淀(CHIP)检测Notch下游靶基因转录水平的变化。结果 PDGF-BB显著促进HPAC增殖,提高细胞Notch表达水平,增强Notch靶基因的转录;不同剂量的DAPT及血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂处理细胞,显著反转了PDGF-BB的作用。结论 Notch信号通路在PDGF-BB诱导胰腺癌细胞增殖中起到重要作用。

DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究

目的:研究随着时间延长,DAPI标记间充质干细胞(MSCs)的标记率变化。方法:分离培养纯化成年大鼠骨髓MSCs,DAPI标记,不同时点荧光显微镜观察,计算MSCs中DAPI阳性率。将标记的MSCs移植到缺血下肢模型动物骨骼肌中,不同时点取材,冰冻切片,观察移植细胞。结果:标记当天,荧光镜下MSCs胞核呈明亮蓝色荧光,标记率接近100%,随着培养时间延长,标记率逐渐下降。移植1周和2周组织切片中,可见密集移植MSCs,3周以后,可检出的DAPI阳性细胞明显减少。结论:DAPI短期标记细胞效率很高,但标记率随着时间延长而迅速下降。

中耳胆脂瘤中DAPI核染色、FOXO3和Bim的表达和意义

目的检测中耳胆脂瘤中人类叉头框O3(forkhead box O3,FOXO3)、唯BH3域蛋白(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)的表达和相关性,以及Bim和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色的相关性,探讨FOXO3和Bim在中耳胆脂瘤中的作用。方法应用免疫组化染色(immunohistochemistry)检测30例中耳胆脂瘤标本及15例正常皮肤中FOXO3、Bim的表达和定位;通过免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)检测这些标本中Bim和DAPI的染色情况;应用Western blot检测以上标本FOXO3、Bim及内参的表达情况;分析Bim和DAPI核染色的相关性、Bim和FOXO3表达的相关性。结果①免疫组化染色显示,FOXO3在胆脂瘤和正常皮肤的细胞核及胞质均有着色,在胆脂瘤细胞核中FOXO3的阳性样本率(36.7%,11/30)明显低于正常皮肤(86.7%,13/15)(χ^(2)=10.04,P<0.05);胆脂瘤细胞胞质中FOXO3的阳性率(30.0%,10/30)也显明低于正常皮肤(80.0%,12/15)(χ^(2)=8.72,P<0.05)。Bim主要定位于胆脂瘤和正常皮肤的细胞质,其在胆脂瘤中的阳性率(53.3%,16/30)明显低于正常皮肤组织(93.3%,14/15)(χ^(2)=7.20,P<0.05)。②免疫荧光染色显示DAPI和Bim在胆脂瘤的荧光值(分别为25.37±3.67和35.16±4.21)均弱于正常皮肤(分别为91.45±10.14和82.51±7.34),差异有统计学意义(t=1.93,P<0.05;t=1.71,P<0.05)。③Western blot检测显示胆脂瘤中FOXO3和Bim的表达均明显低于正常皮肤,差异具有统计学意义(t=2.01,P<0.05;t=1.99,P<0.05)。④在中耳胆脂瘤标本中,FOXO3和Bim呈正相关(r=0.362,P<0.05);Bim和DAPI呈显著正相关(r=0.501,P<0.01)。结论FOXO3/Bim信号通路在中耳胆脂瘤的形成过程中发挥了作用,且该作用与抗凋亡有关。

Ki67与核酸荧光共染在细胞周期研究中的应用

病原微生物与宿主细胞的相互作用是感染过程中的一个重要环节,也是研究肿瘤生物学的一项重要内容。动态研究细胞周期变化对了解病原体作用于细胞具有重要意义。本研究用Ki67/4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)和Ki67/碘化丙啶(propidium iodide,PI)共染技术分析了小鼠脾细胞的细胞周期变化,并介绍其具体应用。

CM‑Phos配体在钯催化交叉偶联反应中的应用

本文综合评述了近年来2-[2-(二环己膦基)苯基]-1-甲基-1H-吲哚(CM-Phos)膦配体及其衍生物在钯催化的交叉偶联反应中的应用,主要根据不同种类的交叉偶联反应进行系统性分述,并对该领域的发展前景进行了展望.

小鼠DC、NK细胞体外诱导、增殖及示踪方法

目的研究小鼠自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)体外诱导增殖及其过继免疫后示踪的方法。方法建立C57BL/6小鼠皮下黑素瘤模型,体外诱导、增殖小鼠脾源性NK细胞及骨髓源性DC,进行电镜观察,并在体外以Brdu、DAPI标记,混合两种细胞回输荷瘤小鼠体内,观察肿瘤组织中两种细胞的示踪情况。结果DC、NK细胞在细胞因子诱导下体外成倍扩增,电镜下可见典型的DC、NK细胞。Brdu对细胞的标记率约65%,DAPI对细胞的标记率可达100%。在荧光显微镜下可见肿瘤组织切片中外源性DC、NK细胞的分布。结论Brdu、DAPI均可作为外源性细胞体内示踪的标记方法。

贝类生态综合养殖系统中细菌丰度的变化

2011年4—10月在福建云霄,对以贝类为主的生态综合养殖系统内的藻类池(A池)和贝类池(B池)逐月采样检测,并分析两池水体及B池沉积物中细菌丰度的时空变化规律.结果发现:水体中细菌丰度,B池为1.01×106～4.35×106 cell/mL;A池为1.09×106～6.61×106 cell/mL.A池和B池水体中细菌丰度没有明显的月变化规律,但昼夜变化明显.B池水体中细菌丰度与叶绿素a、总氮、总磷、温度和盐度的关系4—7月呈明显的正相关(r=0.984,n=4);8月细菌丰度急剧下降,因采样期间有连续降雨,细菌丰度变化和降雨可能有一定的关系.A池水体中细菌丰度与叶绿素a呈显著负相关(r=-0.821,n=7),与温度呈显著负相关(r=-0.830,n=7),温度不是影响A池细菌增殖的主要因子.B池底泥样品中细菌丰度比水体中的低,主要可能是水交换和养殖贝类活动共同作用的结果.采样期间发现,在阴雨天气时池塘水面会有泡沫漂浮,细菌丰度高于其所在水体达2.25×107cell/mL,其作用机制有待于进一步研究.

果蔬垃圾堆肥过程中原核生物和真菌的气溶胶化能力

1研究亮点*分析了果蔬垃圾堆肥过程中细菌、古菌和真菌主要种属的优先气溶胶化能力;*低丰度微生物,例如,奇古菌(Thaumarchaeota)也能够优先气溶胶化;*气溶胶化微生物中,致病性微生物属的占比超过90%。2背景微生物气溶胶是指存在于气相介质中由微生物(包括细菌、古菌和真菌等)、微生物细胞碎片和产物组成的分散体系。研究结果表明,气溶胶中的微生物及其产物会对人体造成器官特异性和系统性的健康危害。例如,放线菌、黄曲霉、烟曲霉、赭曲霉毒素、炭疽杆菌、镰刀菌、肺炎链球菌和内毒素等会造成呼吸道感染、炎症和哮喘等健康问题。

人羊膜上皮细胞的体外培养及标记

目的改良人羊膜上皮细胞的培养方法,检测生长特性,观察荧光染料4,-6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记人羊膜上皮细胞(HAECs)的效率。方法取足月剖宫产术后羊膜经胶原酶和胰蛋白酶消化获得上皮细胞。MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞的生长周期,免疫组化对细胞角蛋白进行鉴定。并用DAPI标记,测1、2周荧光阳性率。结果培养的HAECs多角形,生长分为缓滞期、对数增长期和平台期,近80%处于细胞周期的静止期G0。细胞角蛋白keratin阳性表达。DAPI标记1周标记率为100%;2周细胞形态好,标记率不变,荧光强度减弱。结论该实验方法成功培养人羊膜上皮细胞。DAPI短期标记效果理想。

松材线虫荧光显微观察方法比较研究

利用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)、苯胺蓝、吖啶橙等染料对松材线虫进行染色处理,荧光显微镜观察发现松材线虫经不同的荧光染料染色后,产生不同的荧光效果,且荧光效果均强于其自发荧光。尤其以吖啶橙荧光染色最为明显,雄性松材线虫的生殖器官交合伞可以表现出不同颜色的荧光效果。这些结果对于利用荧光染色的方法研究松材线虫形态特征及其分类鉴定均有指导意义。

羽衣甘蓝小孢子胚胎发生观察及再生植株倍性鉴定

以5个不同基因型羽衣甘蓝品种为试材进行游离小孢子培养,研究小孢子发育时期与花蕾形态的关系、基因型对小孢子出胚率的影响、胚成苗及再生植株加倍和倍性鉴定。结果表明:(1)适宜于羽衣甘蓝游离小孢子培养的花蕾形态指标为:蕾长3.5～4.5mm、花瓣/花药为0.85～1.10。(2)在5个供试品种中,‘4105’出胚率最高,每蕾2.45个,其次是‘7341’,每蕾2.18个,‘7340’和‘7348’小孢子出胚情况较差,分别为每蕾1.36和0.51个,而‘7342’没有出胚。(3)采用150mg.L-1秋水仙碱浸泡幼苗根部24h,结合流式细胞仪快速检测植株倍性,发现二倍体总加倍率为78.4%,大大提高了小孢子再生植株的利用效率。

新型IDO1/TDO抑制剂SHR9146的有关物质检测

目的:建立高效液相色谱法进行肿瘤免疫治疗的新型高选择性吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)/色氨酸2,3-加氧酶(TDO)抑制剂(S)-2-(4-(4-(4-(6-氟-5H-咪唑并[5,1-a]异吲哚-5-基)哌啶-1-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)乙醇(SHR9146)的有关物质检测。方法:采用Kromasil C_(18)(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以0.01 mol·L^(-1)磷酸二氢钾缓冲溶液(含0.3%三乙胺,磷酸调节pH至3.0)(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min^(-1),紫外检测波长270 nm。结果:SHR9146与各有关物质的色谱分离良好,色谱响应在0.01~5.0μg·mL^(-1)浓度范围内线性关系良好(r>0.999),检测限和定量限分别约为21.95和73.16 ng·mL^(-1)。利用上述方法,对3批产品的有关物质进行分析,并采用加校正因子的主成分自身对照法计算含量,杂质SHR9146Z-399含量在0.46%~0.60%,SHR9146Z-333含量不超过0.11%,其他单个杂质含量均不超过0.10%,有关物质含量总和低于1.0%。结论:建立的HPLC-UV方法专属性好,检测灵敏度高,可用于SHR9146原料药的质量控制。

移植途径对大鼠骨髓间充质干细胞归巢及肝功能恢复的影响

目的探讨移植途径对骨髓间充质干细胞(MSCs)归巢及促进肝切除大鼠肝再生的影响。方法建立肝切除大鼠模型,随机分为3组,即肝切除对照组、尾静脉移植组和门静脉移植组。移植组分别经尾静脉和门静脉注射DAPI标记的MSCs约1.5×106/只,分别于第3天和第9天后采血清检测肝功能,第9天处死大鼠取肝脏标本,并通过荧光显微镜观察两种移植途径对MSCs向肝脏迁移的影响。结果门静脉移植组(18.1±3.4)个细胞/100倍视野到肝脏归巢及定植的MSCs多于尾静脉移植组(7.6±2.0)个细胞/100倍视野,差异有统计学意义(P<0.01)。术后第9天各组大鼠肝功能均有好转,丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)3组之间对比差异无统计学意义(F=2.822,1.046,P=0.057,0.365,P>0.05);但两移植组与单纯肝切除组比较血浆白蛋白(ALB)均有明显升高,差异具有统计学意义(F=6.259,P=0.006);尾静脉移植组与门静脉移植组两移植组之间相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论移植途径对MSCs归巢、定植到肝脏有一定影响,门静脉途径优于外周静脉,MSCs移植对肝大部切除大鼠肝功能恢复具有促进作用。

冬虫夏草、蛹虫草菌丝隔膜和细胞核荧光染色

冬虫夏草和蛹虫草作为重要的药用真菌,得到广泛的重视,迄今已有大量的研究报道。然而,作为细胞学研究的基础处理方法,其菌丝隔膜和细胞核染色却缺乏必要的研究。荧光染色是一种程序简便、快速灵敏的染色方法。本研究选用DAPI、PI、Calcoflour White和刚果红等4种染料,对冬虫夏草、蛹虫草菌丝的隔膜和细胞核进行单独与组合染色实验,通过显微观察比较得出较好的染色方法。结果表明DAPI对冬虫夏草和蛹虫草菌丝的细胞核染色效果都较好,而Calcoflour White对两者的细胞壁染色效果较好且隔膜清晰。DAPI与Calcoflour White两者进行冬虫夏草菌丝组合染色的效果为最佳,但在蛹虫草菌丝染色中效果不太稳定。对蛹虫草菌丝较好的组合染色是DAPI与刚果红的组合,但其染色结果需要在激光共聚焦显微镜下观察。

多聚磷酸盐:菌体内多功能调控子和环境压力守护者

多聚磷酸盐(polyP)是由几个到上百个磷酸基团组成并由高能磷酸酐键连接的链状无机化合物,广泛地存在于所有生命体中。研究表明,polyP在不适宜的生存条件下会在菌体内聚集,使菌对环境压力有极强的耐受性,它与其相关的酶PPK、PPX、ppp Gpp等一起作出应激反应;在寡营养环境下,polyP作为能量和磷源库,和Rpo S、Lon蛋白及σ因子等一起参与一系列饥饿压力应答,这种存活机制与寡营养菌的生活方式类似。这些反应得益于polyP链状的灵活性和高荷电性,但是其具体的调控机理仍很少为人所知。本文阐述了以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-phenylindole,DAPI)为基础的荧光染色方法进行菌体内polyP的定性(荧光或电子显微镜)和定量(荧光分光光度计),重点归纳分析了以polyP为核心的关于细菌适应恶劣生存环境的代替机制。