发菜中GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因的克隆及原核表达

前期采用RNA-Seq技术对高盐胁迫下的发菜样品进行转录组测序,发现GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因转录水平较正常培养条件上调2.18倍。基于转录组测序结果,通过同源相比对分析设计引物,以发菜基因组为模板克隆GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因,获得长度为1 080 bp的核酸序列。通过生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要构成方式为随机卷曲和α螺旋,是亲水性蛋白,酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸磷酸化位点个数分别为13、15、17,蛋白质分子质量为41.08 ku,等电点为5.73。正负电荷氨基酸残基数分别为38和46。随后,将该基因插入质粒p ET-28a中成功构建重组表达质粒,然后转化至BL21大肠杆菌感受态中进行原核表达。在OD值为0.8时,用1 mmol/L IPTG在16℃下诱导表达20 h后,获得预期大小重组蛋白(41.08 ku)。该研究首次成功克隆得到发菜GDP-甘露糖4,6-脱水酶基因,并成功构建重组表达质粒于大肠杆菌高效表达。