球毛壳菌60S核糖体蛋白L10a基因克隆与特性分析

用粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)XP_322380和赤霉菌(G ibberella zeae)PH-1(EAA76971)的60S核糖体蛋白L10 a基因(60S ribosom al prote in L10 a,RPL10 a)蛋白序列对球毛壳菌(Chaetom ium globosum)ESTs序列数据库进行tB lastn检索,获得了球毛壳菌RPL10 a cDNA序列。cDNA序列长765 bp,开放阅读框654 bp,编码217个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为23.9 kD。B lastP分析表明该基因氨基酸序列与粗糙脉胞菌相似最高为89%;与玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)相似性最低为78%。cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY669070,AAT74578)。

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因(TaRPL8),探索其应用前景。方法用RT-PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPL8基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPL8基因可在大肠埃希菌BL21/DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。

马铃薯60S核糖体蛋白L28-1基因的生物信息学分析

以马铃薯与青枯菌互作过程中产生的一条EST为实验材料,初步推定该EST表达蛋白可能参与马铃薯青枯病的抗性。通过对这条上调表达的EST核酸构成、氨基酸的构成和该EST编码的可能蛋白质的高级结构进行初步的推理剖析、序列分析,结果表明:该EST的长度为601bp,其中部有429个碱基编码了含143个氨基酸的肽段,该小肽一端是明显的亲水的,一端为显著的疏水的,无信号肽,无二硫键,无膜穿透性,二级结构中含有的无规则卷曲比较多,有多个磷酸化位点,含保守结构域,经分析,与野生种潘那利番茄RPL28-1相似度最高,默示与野生种潘那利番茄RPL28-1拥有大致差不多的构造,发挥出差不多作用。因此以上结果可以为进一步研究该基因编码蛋白的具体功能和在青枯菌与马铃薯互作过程中发挥作用。

犬钩虫核糖体蛋白L36及S4A全长cDNA克隆与蛋白特性分析

目的克隆犬钩虫Ancylostoma caninum核糖体蛋白L36(AcaRPL36)及S4A(AcaRPS4A)全长cDNA序列,并对编码的蛋白特性进行分析,探讨它们在研究系统发育中的应用。方法运用3′RACE技术并结合RT-PCR技术先后分别从犬钩虫中克隆核糖体蛋白L36及S4A的部分序列,经拼接后获得全长cDNA序列。用BlastP搜索相似性序列及保守结构域,所获序列在GenBank中登记,并用Neighbor-Joining(NJ)法构建基于RPL36及RPS4氨基酸序列的系统发育树。结果AcaRPL36全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490128)为390 bp,开放阅读框为315 bp,编码104个氨基酸组成的蛋白;AcaRPS4A全长cDNA序列(GenBank登录号为EF490129)为880 bp,开放阅读框为786bp,编码261个氨基酸组成的蛋白。RPL36及RPS4序列较保守,与Caenorhabditis elegans等的亲缘关系较近的生物,在系统发育树中的遗传距离也较近。结论首次获得犬钩虫RPL36及RPS4A,RPL36和RPS4可能作为分子指标应用于研究生物系统发育。

巴西橡胶树线粒体50S核糖体蛋白L21 cDNA的克隆与分析

在橡胶生产中,"死皮"生理综合症严重制约了橡胶树(Hevea brasiliensis)单产的提高。在早期构建的差减文库中,筛选到一条在死皮植株中下调表达的基因片段,该片段编码的蛋白与线粒体50S核糖体蛋白L21(mRPL21)同源。通过ESTs序列拼接和RT-PCR,获得一条853 bp的cDNA序列(命名为HbmRPL21,GenBank登录号为HM800425),该序列包含一个完整的开放读码框,编码271个氨基酸,理论分子量为30.52 kD,等电点为8.40。同源比对表明,植物和动物界间mRPL21序列差异很大,而植物界内则相对比较保守。生物信息学分析表明,HbmRPL21是一个包含Ribosomal_L21p保守结构域的线粒体定位蛋白。

非小细胞肺癌组织p-mTOR、p70s6k、PTEN蛋白的表达变化及其意义

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)组织中磷酸化的哺乳动物雷帕霉素蛋白(p-m TOR)、核糖体40 S小亚基S6蛋白激酶(p70s6k)及第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)蛋白的表达变化,并探讨其临床意义。方法选取NSCLC组织标本82例份为肺癌组,肺癌同侧远端肺泡组织标本46例份为肺泡组,正常支气管黏膜标本50例份为支气管组。采用SP免疫组织化学法检测各组p-m TOR、p70s6k及PTEN。分析PTEN、p70s6k及p-m TOR表达与NSCLC临床病理参数的关系。结果肺癌组p-m TOR、p70s6k阳性表达率均高于肺泡组及支气管组(P均<0.05)。肺癌组PTEN阳性表达率均低于肺泡组及支气管组(P均<0.05)。p-m TOR表达与NSCLC肿瘤分化程度、临床分期有关(P均<0.05),PTEN表达与NSCLC肿瘤分化程度、淋巴结转移、临床分期有关(P均<0.05)。NSCLC组织PTEN与p-m TOR、p70s6k阳性表达呈负相关(r=-0.38,-0.478;P均<0.01);pm TOR、p70s6k阳性表达呈正相关(r=0.311,P<0.01)。结论 NSCLC存在p-m TOR、p70s6k高表达及PTEN低表达,p-m TOR、p70s6k可能协同促进NSCLC的发生发展,PTEN可能在NSCLC的发生发展中起抑制作用。

猪脑心肌炎病毒3AB蛋白与宿主蛋白RPL11相互作用的鉴定

为了研究与猪脑心肌炎病毒(EMCV)3AB相互作用的宿主蛋白,本实验采用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞cDNA酵母表达文库,获得6个与EMCV 3AB相互作用的宿主蛋白(RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20和LGALS1),经分析显示这些蛋白分别参与DNA复制、有丝分裂和细胞凋亡等过程;酵母共转化试验与免疫共沉淀试验证实EMCV 3AB和RPL11两者之间存在特异性结合;激光共聚焦试验显示EMCV 3AB与RPL11共同过度表达时,二者共定位在细胞核中,而在EMCV感染状态下,3AB与RPL11主要共定位在细胞质中。另外,EMCV感染HeLa细胞能降低细胞中p53的蛋白水平,但3AB并不直接促进p53蛋白降解,表明EMCV 3AB对RPL11-MDM2-p53通路无影响。本研究发现并证实了RPL11与EMCV 3AB之间的相互作用,为进一步研究RPL11蛋白在EMCV复制中的作用奠定了基础。

人源MDN1蛋白质的电镜结构研究

目的·利用负染电镜技术分析人源midasin AAA-ATPase 1(MDN1,又称Rea1)蛋白质结构。方法·利用CRISPR/Cas9基因编辑方法在Expi293F细胞内源MDN1蛋白质的氨基端敲入3×FLAG纯化标签,采用ANTI-FLAG^(®)M2 Agarose Affinity Gel亲和层析和甘油密度梯度离心的方法分离纯化目的蛋白质;通过负染色电镜技术和单颗粒(single-particle)重构技术探究人源MDN1蛋白质结构。结果·利用亲和层析及密度梯度离心方法分离纯化获得高纯度、均一性较好的人源MDN1蛋白质样品;采用甲酸铀负染色后利用120 kV电镜初步解析了目的蛋白质MDN1的空间结构。结论·利用单颗粒重构技术搭建了人源MDN1蛋白质的低分辨率的负染模型。

玉米中QM同源基因的克隆及其差异表达分析

利用cDNA-AFLP技术和5＇ RACE技术在玉米自交系黄早四Ht2上分离并克隆了QM（编码核糖体蛋白L10）同源基因（命名为ZmQM）。其cDNA全长为967 bp, 开放阅读框为738 bp,。该基因编码245个氨基酸的ZmQM蛋白，分子量为27.78 kD, 等电点（pI）为10.69, 预测含蛋白酶C磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点。玉米ZmQM蛋白与包括人类等l3个物种QM蛋白的同源性比较发现, 氨基酸序列相似性为66%~92%。RT-PCR分析表明, 在接种玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum） 1号小种12 h后, 黄早四Ht2中ZmQM基因表达量较黄早四中明显上调，推测ZmQM基因可能参与黄早四Ht2对玉米大斑病菌1号小种的抗性反应。

解脲脲原体对大环内酯类抗生素耐药机制的研究

目的探索解脲脲原体对大环内酯类抗生素的耐药机制。方法自行设计引物,对已知药敏结果的解脲脲原体进行编码核糖体蛋白L4/L22的基因以及23S rRNA的II区和V区的扩增并测序,比对分析其碱基和氨基酸的改变。结果在耐药株X01核糖体蛋白L4上,出现第67位谷氨酰胺→赖氨酸和71位甘氨酸→丝氨酸的改变;敏感株Y292经阿奇霉素诱导耐药后,L22核糖体蛋白上出现9个氨基酸的改变;耐药株Y187 23S rRNAV区出现第2566位碱基T→C、第2569位缺失碱基G和第2621位碱基A→T的变化。结论核糖体蛋白L4、L22以及23S rRNA上相应区域碱基、氨基酸的改变,可能是导致解脲脲原体对大环内酯类抗生素出现耐药的机制之一。

QM基因研究进展

对QM基因的研究进展做了综述,希望为深入开展不同物种QM基因功能研究提供一些参考。

栀子高质量总RNA的提取

利用改进的高盐高pH值法和EASYspin植物RNA快速提取试剂盒,从富含次生代谢产物的栀子叶片和果实中提取总RNA。用紫外分光光度法和1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量,0.7%非变性琼脂糖凝胶电泳检测反转录产物质量,利用RT-PCR反应检测反转录产物用于基因扩增的有效性。结果表明,高盐高pH值法提取的栀子果实总RNA,试剂盒法提取的栀子叶片总RNA产量均较高,28S和18S条带清晰,28S条带亮度是18S条带的2倍,且A260/A280在1.9~2.0;以提取的RNA为模板反转录的cDNA长度范围较广（250~5000bp）;上述反转录获得的cDNA均能够成功用于60S核糖体蛋白L18A基因片段的扩增。综上所述,利用高盐高pH值法提取栀子果实总RNA、利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取栀子叶片总RNA,效果最好。本研究成功建立了从栀子果实和叶片中提取高质量总RNA的方法。

大环内酯类药物次抑菌浓度诱导沙眼衣原体耐药的实验研究

目的:探讨沙眼衣原体对大环内酯类药物的分子耐药机制。方法:13例沙眼衣原体临床敏感株经红霉素、阿奇霉素、交沙霉素诱导耐药后与未耐药之前的敏感株和标准株E-UW-5/Cx比较,检测基因23SrRNA和核糖体蛋白L4的位点突变。结果:耐药株显现出对红霉素、阿奇霉素和交沙霉素低耐药性,MIC较敏感株分别增加了16、16、8倍。药物敏感性结果显示相对于红霉素、阿奇霉素,沙眼衣原体治疗交沙霉素的易感性最好。敏感株和耐药株的L4的PCR扩增产物的序列均出现G274A、C276T、C339T、C466G位点突变,考虑与大环内酯类药物耐药无关。耐药株的23SrRNA基因PCR扩增产物中出现了A2057G、A2059G和T2611C的突变。结论:沙眼衣原体对大环内酯类药物的耐药分子基础是23SrRNA基因的点突变。

PTEN和S6K1在Ⅰ型子宫内膜癌中的表达及意义

目的探讨子宫内膜癌组织中10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PETN)和核糖体蛋白S6激酶-1(S6K1)的表达情况及其临床意义。方法选择2013年1月至2015年6月徐州医科大学附属医院及徐州市中心医院妇科行手术治疗的患者在病理科存档的组织蜡块,标本中子宫内膜癌组织65例,子宫内膜不典型增生组织30例,良性增生的子宫内膜组织30例,用免疫组化法分别检测PTEN、S6K1在不同内膜组织中的表达情况,分析两者的表达与子宫内膜癌患者各临床病理特征的相关性;对所有子宫内膜癌患者进行术后随访,采用Kaplan-Meier法进行生存分析,Cox比例风险回归模型分析子宫内膜癌患者预后的影响因素。结果(1)PTEN在子宫内膜癌组织中的阳性表达率低于正常子宫内膜组织及不典型增生子宫内膜组织(P<0.05);S6K1在子宫内膜癌组织中的阳性表达率较不典型增生子宫内膜组织、正常子宫内膜组织均增高(P<0.05)。(2)不同年龄及FIGO分期、是否淋巴结转移子宫内膜癌组织中的PTEN表达差异无统计学意义(P>0.05)。浸润深度为≥1/2肌层的PTEN阳性表达率(27.3%)显著低于无或<1/2组(59.4%),低-中分化的PTEN阳性表达率(23.3%)显著低于高分化组(60.0%)。不同年龄、不同肌层浸润深度子宫内膜癌组织S6K1阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅱ~Ⅳ期、低-中分化及有淋巴结转移的S6K1阳性表达率(分别为72.4%、76.7%、81.3%)显著高于Ⅰ期、高分化及无淋巴结转移者(47.2%、42.9%、51.0%)。(3)Kaplan-Meier生存分析显示,PTEN阴性表达患者的平均生存时间短于阳性表达患者(P<0.05);S6K1阳性表达患者的平均生存时间短于阴性表达患者(P<0.05)。(4)Cox回归分析显示FIGO分期、病理分化程度、肌层浸润深度、淋巴结转移及PTEN、S6K1的表达是子宫内膜癌患者预后影响因素(P<0.05,P<0.01),其中FIGO分期、淋巴结转移及PTEN、S6K1的表达是影响子宫内膜癌预后的独立影响因素(P<0.05,P<0.01)。结论在子宫内膜癌组织中,PTEN的阴性表达和S6K1的阳性表达与子宫内膜癌的发生、发展及预后相关。