非洲猪瘟病毒B646L基因序列分析及p72蛋白质结构与细胞抗原表位预测

为探究非洲猪瘟病毒B646L基因序列的碱基组成特点,及预测该基因所编码的p72蛋白质结构与细胞抗原表位,利用PCR技术对非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框的序列进行扩增、测序及碱基组成分析;运用软件EXPASY、PRABI与SWISS-MODEL对p72蛋白质进行理化性质分析及二、三级结构预测;运用在线软件ABCpred Prediction、Scratch、IEDB和NetCTL对p72蛋白在B、T细胞的抗原表位进行预测。结果表明,非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框序列全长为1941 bp,其中,碱基A含量为26.9%,T含量为28.9%,G含量为24.2%及C含量为20.0%,A+T的含量为55.8%,G+C的含量为44.2%,AT含量显著高于GC含量;该序列共编码646个氨基酸,p72蛋白大小为76 ku;在整个p72蛋白分子的二、三级结构中,α-螺旋占19.35%,β-转角占5.42%,无规卷曲占50.15%,扩展链为25.08%,以无规卷曲为主要结构;该蛋白存在细胞质的概率最大,其次是细胞核,存在于线粒体、高尔基体和内质网的概率较低;p72蛋白B淋巴细胞优势抗原表位分别为12~18 aa、27~37 aa、45~55 aa、77~88 aa、110~120 aa;T淋巴细胞优势抗原表位分别为203~212 aa、298~307 aa、520~531 aa。说明非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框序列呈明显AT偏好性;p72蛋白为一亲水性蛋白,其高级结构主要以无规卷曲为主,且具有B、T淋巴细胞优势抗原表位,是检测试剂和疫苗研发的理想靶标。

非洲猪瘟病毒B646L和F778R双基因PCR检测方法的构建

为建立一种能够快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的普通PCR方法,本研究分别以ASFV B646L和F778R基因为靶序列设计了两对特异性引物,建立ASFV B646L和F778R双基因普通PCR方法,并对其特异性、灵敏性及重复性进行检测。结果显示:该PCR体系(25.0μL体系)的最优组合为Pfu酶0.2μL、10×Reaction Buffer 2.5μL、2.5 mmol/L d NTP Mixture 2.5μL、B646L上下游引物各1.5μL、F778R上下游引物各0.5μL、DNA模板1.0μL;退火温度为57℃、退火时间为30 s、72℃延伸2.5 min,30个循环。该方法仅针对ASFV B646L和F778R基因进行特异性扩增,无交叉反应。同时对B646L和F778R阳性质粒的最低检测下限分别为7.2×10^(7)copies/μL、1.5×10^(6)copies/μL,试验重复性良好。本研究对于提高ASFV临床诊断的准确性、特异性和高效性具有重要价值,为其快速检测提供了可靠的技术支撑。

非洲猪瘟病毒MGF-505R基因缺失株双重荧光RPA检测方法的建立及应用

旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法,以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势,选择MGF-505R基因及B646L基因,设计特异性引物及exo探针,对其进行敏感性、特异性分析,并进行临床应用。利用双重-重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测ASFV MGF-505R及B646L基因,结果显示:检测时间在15 min内,最低检测限均为10 copies/反应,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;利用所建立方法对266份临床样品进行检测,结果与世界动物卫生组织(WOAH)推荐荧光PCR检测方法的符合率为100%。建立的ASFV MGF-505R基因缺失株的荧光RPA检测方法适配可移动式荧光RPA检测仪,具有快速、灵敏度高、特异性强的优点,适用于ASFV现场快速临床检测,为非洲猪瘟疫情防控提供一种新的筛查手段。

鉴别非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株的双重荧光PCR方法的建立

非洲猪瘟病毒I177L基因缺失疫苗是当前非洲猪瘟(African swine fever,ASF)减毒活疫苗研发的重点方向之一。为有效鉴别非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)野毒株和I177L基因缺失株,本试验根据ASFV B646L和I177L基因分别设计特异性引物和探针,经过筛选和优化,建立了双重荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,可同时检测ASFV B646L和I177L基因,与猪圆环病毒2型、塞内卡病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等无交叉反应;灵敏度高,该法对重组质粒pUC57-B646L和pUC-I177L的检出限均为1×10^(3)拷贝/mL;重复性好,批内和批间变异系数(coefficient of variation,Cv)均小于4%。应用该双重荧光PCR方法和WOAH推荐的荧光PCR法对122份猪肉及猪肉制品进行比对检测,2种方法对B646L基因检测结果符合率为100%,且所建立方法阳性结果均出现2条扩增曲线。本研究建立的方法可用于ASFV I177L基因缺失株检测,为ASF监测和流行病学调查提供了技术支持。

非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

本研究旨在用原核生物表达系统来表达非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L基因。获得其编码的p72重组蛋白,并针对纯化的p72重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV B646L全长基因连入pcold-Ⅰ表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导16 h后,利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。然后用纯化的p72重组蛋白为免疫原制备鼠源抗p72多克隆抗体,经过4次免疫后获得p72蛋白的多克隆抗体,随后采取血清来检测多克隆抗体。结果显示,利用p72蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步对ASFV B646L基因建立快速、特异的血清学诊断技术奠定基础。

非洲猪瘟病毒可视化重组酶辅助扩增检测方法的建立与初步应用

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)重组酶辅助扩增(RAA)与核酸检测试纸条相结合的可视化RAA检测方法,本试验根据ASFV的B646L基因(编码p72蛋白)保守区设计特异性的引物和探针,通过优化引物和探针浓度、反应温度和反应时间,确定反应的最佳体系和扩增条件;检测建立的可视化RAA方法的特异性和灵敏性,分析建立方法与非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒对临床样品检测结果的符合率。结果显示,建立的可视化RAA方法的反应体系为25μL,在38℃恒温条件下反应20 min即可在5 min内读取结果;与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等均不发生交叉反应;单个反应可检测到48.75拷贝的病毒核酸。初步临床应用结果显示,建立的可视化RAA方法与商品化的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒检测结果一致,其阴性和阳性符合率均为100%。本试验成功建立的基于ASFV B646L基因的可视化恒温扩增方法具有反应时间短、特异性和灵敏度高、操作便捷等优势,适合现场快速检测和诊断,具有进一步开发潜力。

非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增方法的建立

本文采用实时荧光环介导等温扩增方法建立一种快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的方法。根据GenBank中公布的非洲猪瘟病毒编码主要衣壳蛋白p72的B 646 L基因序列,针对其6个保守区段设计3对引物和1条环介导等温扩增(LAMP)TaqMan探针,对其特异性、灵敏性进行评估,进行临床样本检测试验,并与OIE推荐的实时荧光定量PCR检测结果进行比较分析。结果显示,该检测方法能够特异性地检出ASFV的存在,具有良好的特异性;灵敏度达到1 pg/μL。本方法的特异性、灵敏性及临床样品检测结果与OIE推荐的实时荧光定量PCR检测结果高度一致。

非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立

试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针,并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件,确立LNA-OSN-PCR标准曲线,并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法,对96份临床疑似患病样品进行检测,同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系,建立的LNA-OSN-PCR标准曲线,具有较好的线性(R2=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10^(-1)copies/μL,变异系数小于3%,并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较,检测灵敏度提高10~100倍,在对96份临床疑似患病核酸样品进行检测中,检出55份阳性,41份阴性,比常规的荧光定量PCR具有更高的阳性检出率。并且能获得典型的扩增曲线。试验结合一步法巢式PCR和锁核酸修饰,建立了ASFV一步法巢式锁核酸荧光定量PCR,为检测ASFV提供一种高灵敏度和高特异性且经济实惠的检测方法。

非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株三重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用

针对非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v基因分别设计了引物和探针,经过条件优化,建立了基于TaqMan探针技术的三重荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法与猪场常见病毒的核酸不发生交叉反应,具有良好的特异性;敏感性分析显示,针对B646L、MGF505-2R和CD2v基因的最低检测下限分别为6.5,8.0和14.0 copies/μL;并且该方法在10~10copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,组间变异系数为0.05%~2.68%,组内变异系数为0.10%~1.17%,稳定性良好。进一步针对临床核酸样品的检测显示,本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的荧光定量PCR鉴别检测方法,为临床非洲猪瘟病毒的监测诊断提供了良好的技术支撑。

非洲猪瘟病毒微芯片荧光PCR快速检测技术的建立及初步应用

非洲猪瘟缺乏安全有效的疫苗,其防控有赖于及时、准确的诊断和消毒灭源。本研究在对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L基因序列进行分析的基础上设计引物、探针,建立了基于微芯片的ASFV免提取荧光PCR检测技术。特异性试验结果显示,微芯片PCR可用于我国不同地区ASFV毒株的通用检测,对其他主要猪源病毒均为阴性;敏感性试验结果显示其检测下限为10拷贝/μL;对117份临床样品的检测结果显示,该方法可用于猪全血、淋巴结、脾脏、肌肉样本中ASFV核酸的检测,与世界动物卫生组织推荐的荧光PCR检测方法相符率达100%,且显著简化了检测操作步骤,检测用时缩短在30 min之内,获得农业农村部第一批非洲猪瘟现场快速检测试剂的推荐,应用于养殖场、屠宰场和流通环节中ASFV核酸的检测。