周围神经65KD蛋白在损伤性大鼠坐骨神经中的表达

目的：研究周围神经６５ＫＤ蛋白在损伤性大鼠坐骨神经中的分布与表达。方法：取损伤１５ｄ后的大鼠坐骨神经近侧端及远侧端，冰冻切片，与抗６５ＫＤ蛋白单克隆抗体与切片孵育后，加羊抗小鼠ＩｇＧＨＲＰ，ＤＡＢ反应成色。结果：大鼠坐骨神经远侧端及近侧端中均有６５ＫＤ蛋白阳性免疫反应产物，阳性免疫反应产物位于雪旺氏细胞。阳性免疫反应产物的密度及强度在神经的远侧端大于近侧端。结论：神经诱向因子６５ＫＤ蛋白由雪旺氏细胞产生。在损伤后神经近、远侧端都存在６５ＫＤ蛋白，远侧端的强度大于近侧端，这一浓度梯度可能是诱导再生的神经纤维定向生长过程中的一个重要因素。

周围神经65KD蛋白单克隆抗体的制备

神经化学诱向生长的研究是神经科学中的一个重要方向。本文以自然系统聚丙酰胺凝胶电泳,分离提取坐骨神经损伤后的远侧端中具有诱神经生长作用的65KD蛋白。以该蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术获得一株(VI5E)稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。免疫印迹法表明,该单克隆抗体特异性地与65KD区带结合。免疫组化法显示,在损伤后的坐骨神经远侧端组织中的雪旺氏细胞呈阳性反应。单克隆抗体的制备为进一步阐明该蛋白的生物学特性奠定了基础。

周围神经65KD蛋白对培养鼠胚脊髓运动神经元的影响

目的：为了解周围神经损伤后其远侧端特异性表达的６５ＫＤ蛋白对鼠胚脊髓运动神经元的影响。方法：选用ＳＤ大鼠坐骨神经横断后２周的动物模型，自然凝胶系统电泳分析损伤后神经远侧端中的蛋白组分，将６５ＫＤ蛋白区带胶条与１４天鼠胚脊髓运动神经元联合培养。结果：损伤后２周的坐骨神经远侧端中特异性地出现表达增强的６５ＫＤ蛋白；与含６５ＫＤ蛋白区带胶条联合培养的脊髓运动神经元细胞存活数量多、突起生长旺盛。结论：坐骨神经损伤后其远侧端组织中６５ＫＤ蛋白表达增强，该蛋白具有促进鼠胚脊髓运动神经元存活和突起生长的作用。

大鼠海马中56KD、83KD蛋白诱导神经干细胞向神经元分化的协同作用研究

目的:探讨切割海马伞大鼠海马中56KD、83KD蛋白在诱导神经干细胞向神经元分化方面是否具有协同作用。方法:切割海马伞后的海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,取低分子量区的56KD、65KD和83KD 3条差异蛋白条带电洗脱后以不同的组合加入鼠胚神经干细胞的分化培养液中诱导神经干细胞分化,12天后行MAP-2免疫荧光染色,记数其中MAP-2阳性神经元数,胞体面积和细胞周长。用STATA7.0软件进行方差分析和两两比较。结果:56KD+65KD+83KD组和56KD+83KD组MAP-2神经元的数量是47.1±9.64,43.7±8.41,胞体大,突起丰富;65KD+83KD组、56KD+65KD组、56KD组和83KD组MAP-2神经元的胞体较小,突起较短;65KD组和对照组的神经元胞体最小,突起最短。MAP-2神经元的数量、面积和周长统计分析结果显示:56KD+65KD+83KD组和56KD+83KD组与其他6组均有显著性差异。56KD+65KD+83KD组和56KD+83KD组之间没有显著性差异;65KD+83KD组、56KD+65KD组、56KD组和83KD组四组之间没有显著性差异,但是它们与65KD组和对照组均有显著性差异,65KD组和对照组之间没有显著性差异。结论:56KD、83KD蛋白在诱导神经干细胞向神经元分化方面具有协同作用。

结核分枝杆菌Hsp65-Esat6与hGM-CSF联合DNA疫苗的构建与体外研究

目的:应用分子生物学技术,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以p EGHsp65Esat-6为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,同时从质粒p ORF-h GM-CSF中扩增出基因佐剂h GM-CSF,分别克隆到真核表达载体p IRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并转染Hep G-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.93 kb和0.47kb,测序分析表明克隆的Hsp65-Esat6和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(h GM-CSF)序列与Gen Bank上公布序列完全一致;Western-bolt检测到Hsp65-Esat6融合蛋白相对分子质量(Mr)为75 000 k Da;RT-PCR方法检测出p IGM,p IHsp65GM和p IHsp65-Esat6GM转染组细胞均有h GM-CSF mRNA表达,三组细胞中h GM-CSF基因mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05).ELISA方法检测到p IHsp65-Esat6GM转染组细胞培养上清中h GM-CSF的表达,且与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:成功构建和表达了p IHsp65-Esat6GM质粒,为研制优于卡介苗(BCG)的新型抗结核病的DNA疫苗奠定了基础.

结核杆菌pIHSP65真核表达载体的构建和表达

目的构建结核杆菌热休克蛋白65KD(HSP65)基因真核表达载体pIHSP65,并在Hela细胞中表达。方法从结核杆菌H37Rv株的基因组中扩增HSP65基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点A中,构建pIHSP65真核表达载体,采用阳离子多聚体将其转染到Hela细胞中,用免疫组化染色法检测HSP65基因的表达。结果所克隆的HSP65基因片段经测序完全正确。重组质粒转染Hela细胞后,用免疫组化染色法检测有HSP65蛋白的表达。结论成功构建了结核杆菌pIHSP65真核表达载体,并在Hela细胞中有效表达,为构建双抗原双顺反子真核表达质粒,以及在整体动物水平的实验研究奠定了基础。