湖羊SRP68基因多态性及其与生长性状的关联分析

【目的】研究信号识别颗粒68(signal recognition particle 68,SRP68)基因在不同月龄湖羊不同组织中的表达情况,并分析其多态性对湖羊生长性状的影响,以期找到与绵羊生长性状显著相关的分子标记。【方法】利用实时荧光定量PCR检测SRP 68基因在湖羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和背最长肌6种组织中的表达情况,以及在初生、45日龄、4月龄和6月龄时湖羊背最长肌中的表达情况;采用绵羊Illumina OvineSNP50 BeadChip对3024只湖羊SRP 68基因多态位点进行基因型检测;使用SPSS 26.0软件对SRP 68基因多态位点与1974只湖羊生长性状进行关联分析。【结果】SRP 68基因在湖羊不同组织中均有表达,在45日龄和4月龄背最长肌、心脏中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在6月龄背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。SRP 68基因rs421715384 G>A位点在湖羊群体中处于中度多态性(0.25<PIC<0.5),AA和GG基因型个体初生重和2月龄体重均显著高于GA基因型(P<0.05),AA基因型个体5月龄体高显著高于GA和GG基因型(P<0.05),GG基因型个体6月龄体重、管围和胸宽均显著高于AA基因型(P<0.05)。【结论】SRP 68基因与湖羊肌肉发育密切相关,rs421715384 G>A位点可作为湖羊生长性状的潜在分子标记,为湖羊分子育种提供参考。

杆状病毒ac68基因的克隆、表达与抗体制备

目的:对苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa califorica multicapsid nucleopoly hedrovirus,AcMNPV)开放阅读框68(open reading frame,ORF68,ac68)进行原核表达,制备该蛋白的多克隆抗体,为深入研究其功能提供基础。方法:将ac68基因克隆至原核表达载体pET28a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达Ac68蛋白,通过His抗体检测进一步验证所表达的蛋白为带有组氨酸的融合蛋白。以纯化的Ac68蛋白作为抗原,免疫昆明小鼠制备多克隆抗体。结果:实现了ac68基因的原核表达,获得了该蛋白的多克隆抗体并在AcMNPV感染的Sf-9细胞中检测到一条大小为25kD左右的特异杂交带。结论:获得的抗体可用于Ac68蛋白功能的进一步研究。

NtMYB68基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究

【目的】为探究烟草NtMYB68基因在类胡萝卜素和脱落酸合成生物合成中的作用及其对烟株抗旱性的影响。【方法】从烤烟品种K326中同源克隆NtMYB68基因,采用生物信息学分析NtMYB68基因序列特征,利用RT-PCR分析其在烟草不同组织的表达模式。利用基因编辑手段创制NtMYB68敲除材料,并分析NtMYB68基因敲除后对烟株类胡萝卜素合成及抗旱性的影响。【结果】NtMYB68基因有2个拷贝,NtMYB68-1和Nt MYB68-2。NtMYB68在烟草根、茎、叶、花中均有表达,NtMYB68-2的表达水平显著高于NtMYB68-1。NtMYB68敲除材料与对照相比,紫黄质合成基因NtZEP显著上调,紫黄质含量显著增加,脱落酸(ABA)合成基因Nt NCED5表达量达到对照植株的4倍。干旱胁迫下,敲除材料幼苗与对照相比,叶片萎蔫程度更轻,长势更优,复水处理后生长状态恢复的更好。干旱处理前后,敲除植株中ABA的含量均显著提高。【结论】Nt MYB68转录因子能抑制NtZEP和Nt NCED5基因表达,敲除该基因可以提高烟叶中紫黄质的积累,促进脱落酸的合成,从而提高烟株抗旱性。

沉默Sam68基因对Jurkat细胞增殖影响的研究

本研究探讨Sam68基因对人急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat增殖的影响。针对Sam68 mRNA 531-552靶位点设计并合成shRNA,构建pLKO-Tet-On条件性真核干扰载体,制备慢病毒并感染Jurkat细胞;应用强力霉素(Doxycycline)诱导干扰载体表达,用Real-time PCR和Western blot验证干扰效率,用改良MTT法检测沉默Sam68基因对Jurkat细胞活力的影响,用体外细胞集落形成实验观察沉默Sam68基因对细胞集落形成能力的影响,用流式细胞术分析沉默Sam68前后细胞周期的变化。结果表明:与对照组相比,实验组Sam68基因的表达被有效抑制(P<0.05);沉默Sam68基因降低了Jurkat细胞活力,抑制了细胞的集落形成能力并且导致S期细胞比例显著增加,G2期细胞比例显著降低(P<0.05)。结论:利用shRNA靶向干扰Sam68基因的表达可以有效抑制人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞的增殖。

番茄SlNPF68基因参与缺氮条件下根系觅食反应

觅食反应(foraging response)是植物应对矿质养分不足而进化形成的独特机制。本研究发现番茄(Lycopersicon esculentum)幼苗在极度缺氮处理下,整株含氮量明显下降,地上部分生长明显受到抑制,但初生根长度和根总长度显著增加,表现出明显的觅食反应;补充氮后,幼苗生长恢复正常。进一步克隆了番茄SlNPF68基因,发现其开放阅读框长度为1 719 bp,编码572个氨基酸;SlNPF68蛋白分子质量为63.98kDa,理论等电点为9.21,属于碱性不稳定疏水蛋白。序列分析表明SlNPF68属于多肽转运因子(PTR2)家族,与拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtNPF4.5、At NPF6.3相似性较高。表达分析表明Sl NPF68基因在番茄根、茎、叶、花、果实等器官中均表达,且受缺氮诱导上调,在3 d后达到最高,随后下降;补充硝酸盐后,其表达量再次上调。在番茄中超量表达SlNPF68基因可显著增加番茄幼苗初生根长度、根总长度以及平均侧根数。综合以上结果,说明SlNPF68可通过响应缺氮参与根系觅食反应。

金鱼DEAD-box家族基因p68和p110在配子发生中的表达特征

利用组织原位杂交技术,以地高辛标记的反义RNA为探针,检测了金鱼(Carassius auratus)DEAD-box家族基因p68和p110在卵子发生及精子发生中的表达分布特点。结果表明:在金鱼配子发生中,p68基因在各个时期的卵母细胞均有表达,Ⅰ、Ⅱ期卵母细胞中的表达水平较Ⅲ、Ⅳ期卵母细胞中更高。p68基因的表达只限于精原细胞和初级精母细胞中。p110基因在金鱼精子发生各阶段持续表达,其中精原细胞和初级精母细胞中表达水平较高;在卵子发生中,Ⅰ期卵母细胞中没有p110 RNA阳性信号,Ⅱ期卵母细胞中信号较为强烈,但在Ⅲ、Ⅳ期卵母细胞中杂交信号明显减弱。

沉默c2orf68基因对结直肠癌细胞增殖的影响

目的:通过RNA干扰技术抑制人结直肠癌SW480、SW620及LS174T细胞株中c2orf68基因的表达,进一步观察其生物学特性的改变,以阐明c2orf68基因对结直肠癌细胞增殖的影响。方法:利用siRNA在线设计软件设计合成干扰片段,并将2个干扰片段转入所试细胞株中。应用RT-PCR法检测细胞mRNA的表达;利用MTT实验观察细胞增殖情况;应用流式细胞技术检测细胞凋亡。结果:转染siRNA片段后,SW480、SW620及LS174T细胞株的mRNA表达都下降,其抑制率分别为:50.05%、44.79%;49.69%、30.00%;50.15%、45.79%。随后,选取干扰效率高的siRNA1干扰片段做后续实验。MTT实验发现,siRNA转染LS174T细胞后,细胞的增殖能力明显下降,细胞的增殖抑制率为21.2%(P<0.05)。同时,采用流式细胞仪检测细胞的凋亡,实验表明,实验组细胞凋亡率为18.13%(P<0.05)。结论:成功筛选了抑制结直肠癌c2orf68基因的特异性干扰片段,该片段可以下调人结直肠癌细胞株中c2orf68的mRNA,抑制人结直肠癌细胞的生长,促进细胞凋亡,说明该基因可能与结直肠癌的细胞增殖有关,进一步调控相应生物学特性的改变,引起结直肠癌的发生。

PPE68基因重组卡介苗的构建及其免疫原性

目的构建携带结核分枝杆菌PPE68基因的重组卡介苗(BCG),并检测其诱导小鼠的免疫应答情况。方法将带有分枝杆菌复制子OriM的穿梭质粒pBudCE4.1/PPE68/OriM电转化入BCG中,PCR鉴定重组BCG。用鉴定正确的PPE68/OriM重组BCG免疫BALB/c小鼠,每2周免疫1次,共3次,末次免疫后2周采血,分离血清,检测血清中IgG2a、IFNγ和IL-12水平;取脾、肺,分离脾淋巴细胞,检测经特异性蛋白刺激后淋巴细胞的增殖水平;进行脾CD4+和CD8+T淋巴细胞计数,计算CD4+/CD8+比值;检测脾、肺荷菌量并观察组织病理变化。结果 PPE68/OriM重组BCG经PCR鉴定构建正确;其免疫小鼠后,可诱导小鼠血清中IgG2a、IFNγ和IL-12水平显著增加(P<0.05),脾淋巴细胞增殖显著(P<0.05),CD4+和CD8+T细胞百分比增加,CD4+/CD8+T细胞比值降低,脾、肺均无菌落生长且未见明显病理改变。结论成功构建了PPE68基因重组BCG,其免疫BALB/c小鼠能明显提高小鼠的Th1型免疫效应,有利于机体抗结核菌感染。

Sam68基因过表达可促进乳腺癌MCF-7细胞发生上皮-间质转化

目的 :探讨Sam68(Src-associated in mitosis 68 k D)对乳腺癌MCF-7细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、增殖、迁移和侵袭的影响。方法 :将重组质粒pc DNA-3-Sam68转染至乳腺癌MCF-7细胞后,应用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测Sam68以及EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)m RNA及蛋白的表达,CCK-8法和Transwell小室法分别检测细胞的增殖、迁移和侵袭情况。结果:重组质粒pc DNA-3-Sam68转染MCF-7细胞48 h后,Sam68m RNA和蛋白明显过表达(P值均<0.05)。EMT标志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin m RNA的表达水平无明显变化(P值均>0.05),E-cadherin蛋白的表达水平明显下调(P<0.05),而N-cadherin和vimentin蛋白的表达水平则明显上调(P值均<0.05)。并且,细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增强(P值均<0.05)。结论 :过表达Sam68基因可增强乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力,这一作用可能与调控EMT的发生有关。

沉默Sam68基因表达抑制乳腺癌细胞的上皮-间质转化

目的 :探讨沉默Sam68(Src-associated substrated during mitosis of 68KD)基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法 :采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测具有不同侵袭能力的乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中Sam68 m RNA及蛋白的表达情况;选择Sam68高表达的MDA-MB-231细胞,利用si RNA技术沉默细胞中内源性Sam68蛋白的表达。随后,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)m RNA及蛋白的表达;采用CCK-8法、Transwell小室迁移和侵袭实验检测沉默Sam 68基因表达后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,迁移和侵袭的影响。结果 :Sam68蛋白在高侵袭性的间质型乳腺癌MDA-MB-231细胞中高表达(P<0.05);采用si RNA沉默MDA-MB-231细胞内源性Sam68蛋白的表达后,E-cadherin的表达水平明显上调(P<0.05),而vimentin的表达水平明显下调(P<0.05);MDA-MB-231细胞的增殖能力以及细胞的迁移和侵袭能力明显降低(P值均<0.05),细胞可能发生间质-上皮转化。结论 :Sam68在高侵袭性乳腺癌细胞中高表达,沉默Sam68基因的表达能抑制EMT的发生,并降低细胞增殖、侵袭和迁移能力。

黄毛草莓FnbHLH68转录因子基因和启动子的克隆及表达分析

以黄毛草莓为试材,采用RT-PCR技术克隆了1个碱性螺旋—环—螺旋(bHLH)转录因子基因FnbHLH68的cDNA序列(GenBank登陆号:MN879282).序列分析显示,FnbHLH68基因开放阅读框长1161 bp,编码386个氨基酸,包含一个保守的碱性螺旋—环—螺旋(HLH)结构域.同源性分析表明,黄毛草莓FnbHLH68氨基酸序列与森林草莓FvbHLH68氨基酸序列的同源性为98.45%.进一步从黄毛草莓基因组DNA中克隆了FnbHLH68上游1849 bp的启动子序列pFnbHLH68(GenBank登录号:MW218450),预测含有多个响应逆境和激素诱导的顺式作用元件.成功构建了植物过表达载体pCAMBIA1300-HA-FnbHLH68和基因沉默载体pTRV2-FnbHLH68.实时荧光定量PCR检测显示:黄毛草莓叶片接种胶孢炭疽菌12 h后,FnbHLH68基因的表达量达到最高值,为0 h的10.6倍;黄毛草莓叶片用水杨酸处理后,FnbHLH68基因的表达量上升,12 h后达到最高值,为0 h的11.5倍.

赖型钩体DNA重组质粒rpDJt及其表达蛋白P68对豚鼠的免疫保护研究

为了进一步鉴定赖型钩体ＤＮＡ重组质粒ｒｐＤＪｔ及其纯化表达蛋白质Ｐ６８的免疫保护作用，采用随机、双盲和对照法对５０只豚鼠进行了３次和６个部位主动免疫接种，并于接种后３０天以强毒力、大剂量活钩体攻击。结果：Ｐ６８组存活率１００％（７／７）；ｒｐＤＪｔ组存活率７７％（１０／１３）；ｐＴ７－７组（无重组质粒）存活率２５％（３／１０）；全钩灭活疫苗组存活率９３％（１３／１４）。作者认为该质粒的表达蛋白质Ｐ６８可作为钩体基因工程亚单位疫苗的候选抗原。

赖型钩体重组质粒及表达保护性抗原,p68的研究

目的 寻找钩体病基因工程疫苗保护性抗原候选。方法 （１） 鸟枪法构建赖型钩体０１７ 株基因库； （２） α互补、 Ｄ Ｎ Ａ 原位杂交筛选重组质粒； （３） Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交行 Ｄ Ｎ Ａ 同源性分析； （４） 双脱氧链中止测重组 Ｄ Ｎ Ａ 序列及与外膜蛋白基因 （ｏｍｐ） 匹配； （５） Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导重组子表达； （６） 免疫印迹、 Ｍ Ａ Ｔ、 Ｅ Ｉ Ａ、 Ｍ Ｔ Ｔ 检测表达蛋白抗原特性及 Ｉ Ｌ—２ 、 Ｉ Ｌ—６ 活性； （７） 纯化表达蛋白ｐ６８ 进行豚鼠主动免疫 攻击实验， 观免疫保护性。结果 （１） 重组质粒ｐ Ｄ Ｊ Ｈ２ （ 亚克隆ｐ Ｄ Ｊｔ） 插入片段１９ｋｂ ， 与各致病钩体不同片段 Ｄ Ｎ Ａ 高度同源； （２） 序列测定插入片段实际１８１１ｂｐ ， 推测有２ 个读框 （ Ｏ Ｒ Ｆ） ， 各有启动子、终止密码。查 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ｅ Ｍ Ｂ Ｌ 无类似序列； （３） 表达蛋白分子量６８ｋ Ｄ （ｐ６８） ； （４） ｐ６８ 是胸腺依赖性 （ Ｔ Ｄ） 抗原，有良好抗原特性， 抗血清效价１ ： ５２４２８８ ， （ Ｅ Ｉ Ａ） 具很强的动物免疫保护作用。结论 （１） ｐ６８ 编码基因是致病钩体保护性抗原基因； （２） ｐ６８ 是致病钩体外膜保护性抗原，

重组结核分枝杆菌ESAT6-PPE68融合蛋白的制备

目的构建结核分支杆菌esat6-ppe68融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白ESAT6-PPE68。方法用基因拼接(GeneSOEing)法扩增esat6-ppe68融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGesat6-ppe68。重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导表达约69000带谷胱苷肽硫转移酶蛋白(GST)标签的rESAT6-PPE68融合蛋白,经谷胱苷肽-硫-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blotting鉴定。结果重组质粒pGesat6-ppe68中目的基因测序结果与报道序列完全相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Westernblotting结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应。结论成功构建了原核表达载体pGesat6-ppe68,获得了rESAT6-PPE68融合蛋白,为rESAT6-PPE68融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。

白纹伊蚊气味结合蛋白基因OBP68的克隆鉴定及其在蚊不同发育时期表达分析

目的克隆鉴定白纹伊蚊气味结合蛋白基因OBP68,了解该基因在白纹伊蚊不同发育时期表达量的差异。方法提取幼虫、蛹、雄蚊、未吸血雌蚊总RNA,用RT-PCR扩增OBP68基因特异片段,克隆于pMD 18-T载体并测序鉴定;用半定量RT-PCR分析白纹伊蚊不同发育时期OBP68基因mRNA表达量差异。结果从白纹伊蚊扩增出OBP68基因,测序分析克隆白纹伊蚊OBP68基因序列与GenBank注册号FJ04086.1的白纹伊蚊OBP68基因同源性99%,与埃及伊蚊的OBP68基因的同源性为71%。白纹伊蚊OBP68基因在白纹伊蚊发育不同时期皆有表达,以幼虫阶段表达较弱,蛹、雄蚊、雌蚊表达量增高,且后3个时期表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论从白纹伊蚊成功扩增出OBP68基因,该基因在白纹伊蚊不同发育时期均有表达。

B7-H3和CD68＋肿瘤相关巨噬细胞与膀胱尿路上皮癌中的相关性及其对预后的意义

目的 研究B7-H3、CD68＋肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的表达、浸润与膀胱尿路上皮癌临床病理参数的相关性,探讨其对患者预后的指导意义.方法 采用免疫组织化学法检测2008-2010年我院76例根治性膀胱切除术患者尿路上皮癌组织中B7-H3分子的表达以及肿瘤组织中CD68＋TAMs的浸润程度,并进行生存分析.男63例,女13例.年龄41～86岁,中位年龄65.5岁.结果 76例患者中,B7-H3阳性高表达54例（71.1％）,明显高于癌旁（23.3％）和正常膀胱组织（16.7％）的表达率（P＜0.05）.膀胱癌组织中,B7-H3高表达患者性别、年龄,病理分级、分期,复发,淋巴结转移等指标与B7-H3低表达患者相比,差异均无统计学意义（P＞0.05）;CD68＋ TAMs高浸润患者上述临床病理指标与低浸润患者相比,差异亦无统计学意义（P＞0.05）,但B7-H3高表达、CD68＋ TAMs高浸润患者的肿瘤远转移率分别高于B7-H3低表达和CD68＋ TAMs低浸润患者（40.7％ vs.13.6％：50.0％ vs.22.9％）,差异有统计学意义（P=0.023;P=0.015）.Spearman相关分析显示CD68＋TAMs浸润程度和B7-H3表达水平呈正相关（r=0.307,P=0.007）.B7-H3高表达患者中位总体生存时间（0S）、无进展生存时间（PFS）明显低于低表达患者（50个月vs.70个月,P=0.004;33个月vS.59个月,P=0.006）.CD68＋ TAMs高浸润患者的OS、PFS与低浸润患者相比,差异无统计学意义（P＞0.05）;但在CD68＋ TAMs低浸润组中,B7-H3高表达患者中位OS、PFS均低于B7-H3低表达患者（50个月vs.68个月,P=0.034;26个月vS.59个月,P=0.024）.结论 B7-H3分子可以单独或联合CD68＋ TAMs作为评估尿路上皮癌患者根治性膀胱切除术后肿瘤进展的有效指标.联合检测B7-H3分子和CD68＋ TAMs在膀胱癌患者预后判断及靶向治疗中具有潜在的临床应用价值.

马疱疹病毒1型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确地检测马疱疹病毒1型(equine herpesvirus 1,EHV-1),本研究根据EHV-1基因组序列进化分析筛选出特异性较高的ORF68基因的保守区域设计引物与探针,建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该方法线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,最低检测量为10.2拷贝/μL,比常规PCR敏感1000倍;特异性强,检测EHV-2、EHV-4、EHV-5、马动脉炎病毒和马流感病毒均无交叉反应;重复性好,组内及组间样本检测的Ct值均小于等于2%;对2020年收集的60份伴有呼吸道症状的马匹鼻试子进行检测分析显示本方法的阳性检出率(26.67%)高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR(23.33%)和常规PCR(21.67%)。本研究建立了一种快速、灵敏、稳定、特异性强的TaqMan荧光定量PCR检测方法,可用于EHV-1的快速诊断和核酸定量检测,为EHV-1的防控工作提供了有力手段。