三相法提取猪肝酯酶及其在制备D -7-ACA中的应用

酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中,具有作用范围广、底物特异性高等特点。该酶能够催化许多含有酯、酰胺、硫酯或乙酰基的化合物的水解与合成,在生物催化领域具有重要的用途。对来源于猪肝中的酯酶采用三相分离的方法进行了提取,并利用猪肝酯酶的水解特性,研究了其催化7-氨基头孢烷酸(7-ACA)脱乙酰基制备去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)的过程。主要研究结果:确立了三相法分离提取猪肝酯酶的方法,考察了有机溶剂种类、有机溶剂用量、硫酸铵浓度以及体系的pH和提取温度等条件对三相法分离提取猪肝酯酶的影响。实验结果表明在硫酸铵质量分数为45%、异丁醇与水相之比为1∶1、pH7.0、温度为30℃的条件下,酶活回收率为54.84%,纯化倍数为6.32倍。以猪肝酯酶为催化剂,研究了猪肝酯酶催化7-ACA脱乙酰基制备D-7-ACA,在pH7.5、温度35℃、底物浓度2%、酶添加量30 U/mL的反应条件下,7-ACA转化率达到94.33%。

产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达

为了实现GL 7 ACA酰化酶在大肠杆菌中的成功表达 ,将GL 7 ACA酰化酶基因用PCR的方法去除其信号肽序列 ,并将其连接到质粒pET 2 8a ,通过筛选得到了表达GL 7 ACA酰化酶的重组菌BL2 1 (DE3) /pET ACY。分别考察了诱导温度、菌浓 (OD60 0 )、诱导剂IPTG的用量等因素对重组菌表达GL 7 ACA酰化酶的影响。在优化条件下 ,GL 7 ACA酰化酶酶活可达 2 66U/L。GL 7 ACA酰化酶经一步DEAE Sepharose纯化即可达到 80 %的纯度 ,酶活收率为 5 0 %。

GL-7-ACA酰化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

本文报道了利用BamHI酶解的载体pBR322 DNA与Sau3A部分酶解的假单胞菌Ps.130染色体DNA片段构建重组质粒,并用^(32)P标记的寡核苷酸探针从3205个含有外源片段的重组质粒中检测得到7株阳性克隆株。进一步经^(125)I一标记的抗体/抗原放射免疫反应、GL-7-ACA酰化酶活力测定以及酶反应产物的纸谱色层分析,由上述7株阳性株中鉴定出3株能在大肠杆菌中表达酰化酶活力的基因克隆株。对该3株菌的重组质粒——pMR 5、pMR 6和pMR7 DNA的初步凝胶电泳分析表明,pMR 5和pMR 7质粒中插入片段的分子量为6.8kb,质粒pMR 6则带有5.7kb的外源片段。实验还比较了重级质粒pMR5在8株不同的大肠杆菌宿主菌中,GL-7-ACA酰化酶的表达水平。

7-ACA清洁生产的潜力研究

7-ACA是头孢菌素关键性中间体。近年来,头袍菌素类抗生素使用越来越多,临床应用证明它是一类抗菌谱广、抗菌活性强,疗效高和毒性低的抗生素。然而,中国在7-ACA生产过程中普遍面临着污染重、废弃物成分复杂、治理难度大的发展"瓶颈"。本文从清洁生产源头消减的角度,分析了7-ACA清洁生产的潜力与机会,并在国内7-ACA生产现状下,提出了化学法清洁生产方案的建议。

GL-7-ACA酰化酶基因片段的酶谱分析及基因定位

本文报道了从假单胞菌130菌株(Pseudomonas sp.130)染色体上克隆得到的6.8kb的GL-7-ACA酰化酶基因片段的限制酶谱,基因定位以及在不同的大肠杆菌基因启动子控制下酰化酶基因的表达水平。结果表明,所克隆的片段上,不存在EcoR Ⅰ、Hind Ⅱ、Cla Ⅰ切点,分别具有一个Hpa Ⅰ、两个Xho Ⅰ、三个BamH Ⅰ以及四个Pst Ⅰ切点,同时初步确定了这些酶切位点之间的相对位置。经过一系列次级克隆研究,GL-7-ACA酰化酶基因已被定位在3.0kb的B_2-B_3-Hpa Ⅰ片段上。实验比较了以pACYC184、pDR540、pUC10等为载体的次级克隆株(分别为pMR9、pMR10和pMR11)在大肠杆菌中酰化酶基因的表达水平,测定数据表明tac启动子的启动活力比tet启动子强,即pMR10的产酶量比pMR9高一倍,而当tac启动子前再串接一个lac启动子时(pMR11),产酶水平并不进一步提高。本文还对假单胞菌基因在大肠杆菌中的表达进行了讨论。

磷酸铵镁沉淀法预处理7-ACA综合废水试验研究

采用磷酸铵镁（MAP）沉淀法对高氨氮7-ACA综合废水进行了预处理试验研究,以Na2HPO4和MgCl2.6H2O作为沉淀剂,探讨了初始反应pH值、n（Mg2＋）：n（PO43-）/：n（NH4＋）投配比及反应时间等因素对氨氮去除效果的影响。结合结晶物SEM分析,确定预处理的最佳工艺条件为：初始反应pH 9.0、n（Mg2＋）：n（PO43-）：n（NH4＋）投配比1.0：1.1：1和反应时间20 min。平行试验结果表明,在最佳工艺条件下,当进水氨氮浓度为1 020~1 190 mg/L时,处理后出水氨氮浓度为小于150.0 mg/L,氨氮去除率在85.0%以上,残磷量小于40.0 mg/L,为7-ACA综合废水的后续生化处理创造了有利条件。

国产固定化GL-7-ACA酰化酶制备7-ACA的工艺优化

通过对国产固定化GL-7-ACA酰化酶和游离酶的表观米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定.结果表明:固定化GL-7-ACA酰化酶的Km和Vm值分别为8.69 mm o l.L-1和76μm o l.g-1m i-n 1,均较游离酶高;在对酶促反应的关键参数底物质量浓度、转化温度、转化pH进行优化后,用固定化GL-7-ACA酰化酶在底物GL-7-ACA质量浓度30 g.L-1、转化温度25℃、转化pH 8.0的条件下转化GL-7-ACA制备7-ACA可连续操作150批以上,转化率和收率均达95%以上.

7-ACA发酵药渣生物炭对水体中Pb(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)的吸附特性

以7-氨基头孢烷酸(7-ACA)发酵药渣为原材料,采用限氧热解法在不同热解温度(300℃、500℃、700℃)条件下制备了7-ACA发酵药渣生物炭(简称药渣生物炭),在利用扫描电镜、比表面积分析、X射线衍射和红外光谱对反应前后的药渣生物炭进行物理化学性质表征基础上,通过吸附动力学和平衡吸附试验,探究了该药渣生物炭对水体中重金属Pb(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)的吸附特征与机理。结果表明:(1)随着热解温度的升高,所制备的药渣生物炭表面官能团不断减少,芳香化程度增加,比表面积增大,对水体中Pb(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)平衡吸附量和吸附速率也随之增加;(2)药渣生物炭对水体中Pb(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)的吸附动力学均符合Lagergren准二级动力学方程,具有快速吸附、缓慢平衡的特点,吸附速率主要受化学作用控制;(3)Langmuir模型能很好地描述药渣生物炭对水体中Pb(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)的等温吸附过程,吸附特征近似单分子层吸附,药渣生物炭对水体中Pb(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)的最大吸附量分别达到434.78 mg/g和181.81 mg/g;(4)药渣生物炭对水体中Pb(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)的吸附机理主要包括沉淀作用、络合作用、离子交换作用和阳离子-π键作用。

GL-7-ACA酰化酶的固定化工艺条件优化

采用单因素和Box-Behnken实验对LX-1000EP树脂固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的工艺条件进行优化。首先通过单因素设计研究载体用量、缓冲液pH值、时间、温度四个因素对固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶活力的影响,在此基础上,利用响应面试验设计对LX-1000EP树脂固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的条件进行优化。载体用量、缓冲液pH值、时间、温度对固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶都有影响,固定化最佳工艺条件为:载体用量3.3 g、pH值7.9、时间40 h、温度25℃,在此条件下固定化酶活力达到(69.5±0.8)U/g,酶活回收率达到42.41%。将响应面法应用于固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶条件的优化是可行的。

固定化酶解法合成7-ACA的方法研究

天然类头孢菌素C通过化学法或酶解法可制得半合成头孢菌素的重要母核7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。主要研究头孢菌素C在自制固定化CA-Co-Fe/KIT-6催化下,通过一步裂解制备7-ACA的方法,先自行合成负载Co-Fe活性组分的KIT-6载体,再将头孢菌素脱酰酶(CA)通过物理吸附固定在Co-Fe/KIT-6上。经过正交实验,优化了7-ACA的制备条件:温度28℃,p H 8. 0,底物浓度4%,固定化CA酶用量0. 3 g,时间40 min,反应液中7-ACA浓度93. 5%,收率84. 3%。第5次使用经离心回收的固定化CA-Co-Fe/KIT-6,其相对酶活性为87. 6%,7-ACA收率为78. 4%。

假单胞菌sp.130 GL-7-ACA酰化酶的核苷酸和蛋白质序列分析

对来源于假单胞菌sp .130的戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL 7 ACA)酰化酶结构基因的全序列及所编码蛋白质的α,β亚基的N末端和C末端的氨基酸序列进行了测定。将蛋白质序列与其他同类的GL 7 ACA酰化酶进行了同源性比较 ,结果显示该酶与来源于假单孢菌GK16和C42 7的酰化酶的序列有较高同源性 ,而与其它同类酰化酶的同源性较低。这些酶的α亚基N 末端差别较大 ,但是 β 亚基的N

7-ACA的吸收值对HR-756色级影响的探讨

目的:探讨7-ACA 的吸收值对 HR-756成品色级的影响。方法:用紫外分光光度计测定7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的吸收值,对7-ACA 的重结晶处理。结果:7-ACA 吸收值的变化对 HR-756色级有较大的影响。结论:对7-ACA 的质量控制只有含量、水份是不够的,必须对其吸收值进行规定,而且7-ACA 贮存不当会使7-ACA 吸收值上长,对 HR-756的色级影响较大。

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL 7 ACA)酰化酶 (3 1 5 11)可有效催化GL 7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成 7 氨基头孢烷酸 (7 ACA)而成为两步酶法生产 7 ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL 7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR2 0 4 pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7 5～ 8 5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4 0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过 5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率 ,即比酶活看 。

GL-7-ACA酰化酶的分离纯化及性质研究

CU334是高表达GL-7-ACA酰化酶工程菌,其菌悬液用超声波处理后,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、DEAE—纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤及羟基磷灰石吸附柱层析等步骤,得到了凝胶电泳均一的GL-7-ACA酰化酶蛋白,纯化了22倍,得率4.0％,比活力为13.8U/mg。用浓度梯度PAGE测得GL-7-ACA酰化酶的分子量为134kD,用SDS-PAGE测得两个亚基分子量分别为15.5kD和58.4kD。用PI法测得等电点为3.5。GL-7-ACA酰化酶反应最适pH为7.0。反应最适温度为37℃,GL-7-ACA酰化酶对底物GL-7-ACA的K_m值为0.50mmol/L,V_(max)为13.10U·mg^(-1)。Ca^(2+)、EDTA和巯基乙醇对该酶有激活作用,Cu^(2+)、Fe^(2+)和Mg^(2+)等有一定程度的抑制作用。产物7-ACA、戊二酸均为GL-7-ACA酰化酶的反竞争性抑制剂,其K_1值分别为16.58mmol·L^(-1)和9.88mmol·L^(-1)。

利用粘红酵母静息细胞高效转化7-ACA成7-ADCA

采用粘红酵母静息细胞将7-ACA转化为7-ADAC。发酵72h后收集菌体,在底物浓度为6%的pH8.25硼酸盐缓冲液中反应,温度25℃,底物1h内转化完全。分离提取后获得纯度98%的7-ADAC,总收率为88%。

沸石吸附7-ACA废水中COD_(Cr)和NH_3-N的试验研究

以抗生素原料中间体（7-ACA）废水为研究对象，天然沸石及改性沸石为吸附材料，考察了废水初始pH值、沸石粒径、沸石投加量、吸附时间及沸石酸、碱、盐改性对废水中CODcr和NH3-N去除效果的影响。单因素实验结果表明，天然沸石处理废水的适宜条件为：废水初始pn值7．5，沸石投加量20g/L，沸石粒径1--2mm，吸附时间150min。此条件下天然沸石对废水中CODc，和NI-13-N去除率分别为35．3％和23．O％。盐酸改性沸石对废水中CODc，和NH3-N去除效果明显优于氢氧化钠改性沸石和氯化钠改性沸石。1mol／L盐酸改性沸石投加量为15g／C，对废水中CODcr和NH3-N去除率均大于改性前，分别为48．4％和40％。

溴乙酰-7-ACA合成过程中杂质的分析

目的剖析溴乙酰-7-ACA合成过程中主杂质的结构,解决产品质量问题。方法利用红外、核磁、质谱、元素分析等技术对未知物进行结构确证。结果该杂质为二溴乙酰-7-ACA。结论该杂质是原料质量控制不好而引起,并非是在实际生产过程中引入。

7-ACA粉体燃爆机制的热动力学研究

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)粉体在生产过程中存在燃爆危险性,为探究7-ACA粉体的燃爆机制,开展粉体燃烧特性试验。采用热重分析(TGA)方法研究10、20和30℃/min等3种升温速率下,7-ACA粉体燃烧的热动力学过程。结果表明:在升温速率为10℃/min下,7-ACA粉体最低着火温度为220℃,升温速率越大,最小着火温度越高,最大失重速率对应的温度越高。在整个反应过程中,裂解阶段活化能为7.347 kJ/mol,频率因子为1.4×10~7,反应为1.5级反应;燃烧阶段活化能为146.99 kJ/mol,频率因子为9.18×10^(11),反应为2级反应。整个过程热动力学参数值都不高,7-ACA粉体能被较小能量点燃,有燃爆危险。

头孢类抗生素的新型中间体D-7-ACA

目的:研究新型头孢中间体D-7-ACA的特点、性质和应用。方法:查阅现有文献和专利,研究、分析并总结出D-7-ACA在头孢抗生素合成中的应用。结果:D-7-ACA作为合成头孢类抗生素的中间体,可替代7-ACA,简化操作步骤。结论:新型头孢中间体D-7-ACA可用于多种头孢类抗生素的合成。

GL-7ACA酰化酶的提取

假单孢菌79u-18菌株产生GL-7ACA的同时产生β-内酰胺酶。我们找到了一种简单有效的方法使β-内酰胺酶失活而不影响GL-7ACA酶活力。用冻融 -溶媒法提胞内酶GL-7ACA。酶回收率达60％以上,可用于工业化生产。