7-二氟亚甲基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素对大鼠压力性尿失禁模型的疗效及其机制

目的:探讨7-二氟亚甲基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素(7-difluoromethy-5,4'-dimethoxygenistein,DFMG)对SD大鼠压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)模型的疗效及其机制。方法:采用模拟妊娠、难产产伤及卵巢去势建立SD大鼠SUI模型,分为正常对照组、SUI组、DFMG(10,20 mg/kg)组,模型鼠行DFMG隔日灌胃治疗。采用膀胱最大容积(maximal bladder capacity,MBC)、漏尿点压力(leak point pressure,LPP)、腹部漏尿点压力(abdominal leak point pressure,ALPP)以及HE染色和Masson染色检测建模效果;采用RT-PCR检测尿道括约肌细胞(urethral sphincter muscles cells,USMCs)mi R-26b及其下游靶基因磷酸酶和肌腱同源染色体(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10,PENT)m RNA表达;用Western印迹检测USMCs细胞PENT,磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K),蛋白激酶B(protein kinase B,AKT),B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax),细胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-9)的蛋白表达;采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测USMCs细胞凋亡率,采用噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]检测尿USMCs细胞增殖率。结果:成功建立SD大鼠SUI模型。HE染色和Masson染色显示:与SUI组比较,DFMG组尿道括约肌病理症状显著改善,MBC,LPP和ALPP均有显著提高(均P﹤0.05)。RT-PCR结果显示:与SUI组比较,DFMG组USMCs细胞mi R-26b m RNA表达升高(P﹤0.05),PENT m RNA表达下调(P﹤0.05)。Western印迹显示:与SUI组比较,DFMG组PENT,Bax,Cyt-C和caspase-3蛋白均下调(均P﹤0.05);而PI3K,AKT和Bcl-2蛋白表达均上调(均P﹤0.05);并伴随USMCs细胞凋亡率降低(P﹤0.05),增殖率增高(P﹤0.05)。结论:DFMG可以显著改善SUI模型鼠尿动力学症状,其机制可能与上调mi R-26b表达、调控PI3/AKT-Bcl-2/Bax信号通路而抑制细胞凋亡有关。

7-二氟亚甲基-5,4’-二甲氧基金雀异黄素拮抗高糖诱导视网膜微血管内皮细胞损伤的浓度效应

目的探讨7-二氟亚甲基-5,4’-二甲氧基金雀异黄素(7-difluoromethyl-5,4’-dimethoxygenistein,dFMGEN)拮抗高糖诱导猴视网膜微血管内皮细胞(retinal capillary endothelial cells,RCEC)损伤的浓度效应。方法用不同浓度的dFMGEN和金雀异黄素(genistein,GEN)作用于高糖损伤的猴RCEC。测定各组乳酸脱氢酶活性,MTT法测定细胞增生抑制率,流式细胞术测定细胞凋亡率,观察不同浓度的dFMGEN及GEN拮抗高糖诱导RCEC损伤的浓度效应关系。结果3.0μmol·L-1和10.0μmol·L-1dFMGEN组及GEN组细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性分别为(106.600±1.172)U·L-1、(96.900±1.677)U·L-1、(99.400±1.113)U.L-1,细胞增生抑制率分别为29.9%、27.3%和29.1%,细胞凋亡率为(20.20±2.35)%、(9.27±1.30)%、(12.80±4.43)%,与高糖损伤组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论dFMGEN能拮抗高糖诱导体外培养的RCEC损伤,并且在一定程度上较其先导化合物GEN所需的浓度低而作用更明显,这种拮抗作用呈明显的浓度依赖性,随浓度的提高作用越明显。

7-二氟甲氧基金雀异黄素对H_2O_2诱导血管内皮细胞与单核细胞黏附的抑制作用

目的探讨7-二氟甲氧基金雀异黄素对氧化应激诱导血管内皮细胞与单核细胞黏附的抑制作用及其机制。方法荧光分光光度计检测单核细胞与血管内皮细胞的黏附,酶联免疫吸附法检测E选择素和细胞间黏附分子1等黏附分子的释放,Western blotting检测P38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平。结果H_2O_2处理血管内皮细胞24 h后,内皮细胞-单核细胞的黏附率显著增加,内皮细胞E选择素和细胞间黏附分子1的释放增加;加入7-二氟甲氧基金雀异黄素后,血管内皮细胞-单核细胞的黏附率以及内皮细胞释放E选择素和细胞间黏附分子1等黏附分子呈浓度依赖性减少。H_2O_2处理血管内皮细胞24 h后,可显著激活P38丝裂原活化蛋白激酶,这一作用可被7-二氟甲氧基金雀异黄素所抑制。给予P38丝裂原活化蛋白激酶特异性抑制剂SB203580亦可阻断H_2O_2诱导的内皮细胞-单核细胞黏附及内皮细胞E选择素和细胞间黏附分子1的释放。结论7-二氟甲氧基金雀异黄素对氧化应激诱导的血管内皮细胞与单核细胞黏附具有拮抗作用,其机制可能与其抑制P38丝裂原活化蛋白激酶的激活进而阻断内皮细胞释放黏附分子E选择素和细胞间黏附分子1有关。

7-二氟甲氧基-5,4′-二甲氧基金雀异黄素对卵巢上皮性癌细胞增值与迁移侵袭作用机制

目的:探讨7-二氟甲氧基-5,4′-二甲氧基金雀异黄素(7-difluoromethoxy-5,4′-dimethoxygenistein,DFMG)对卵巢上皮性癌细胞(skov3)增值、迁移和侵袭能力的影响,并初步探讨其机制.方法:采用CCK-8法检测不同浓度DFMG对skov3增殖的影响和计算半数药物抑制浓度(IC50),并以IC50结果将不同药物浓度处理分为空白组、溶剂组、DFMG组;应用划痕实验检测各组细胞迁移能力,统计各组的迁移面积,比较迁移率;采用Transwell侵袭实验分析各组细胞侵袭能力,记录、比较各组侵袭入小室的细胞数,应用蛋白免疫印迹(Western blot)、细胞免疫荧光和实时荧光定量PCR技术分别检测各组细胞的钙粘附蛋白E(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的蛋白和mRNA表达变化.结果:浓度为40μmol/L的DFMG开始显著抑制skov3的增殖能力,IC50为(113.1±12.1)μmol/L;DFMG能降低细胞迁移及侵袭能力,减少vimentin蛋白及mRNA的表达,增加E-cadherin蛋白及mRNA的表达.结论:DFMG可明显抑制skov3的体外增殖、迁移和侵袭能力,可能与其抑制细胞上皮间质转化有关.

异黄酮Mannich碱衍生物的合成与抗增殖活性研究

本文以间苯三酚和对羟基苯乙酸为原料,经Friedel-Crafts酰基化、增碳关环以及选择性O-甲基化反应合成得到4’,7-二甲氧基金雀异黄酮(1)。再以4’,7-二甲氧基金雀异黄酮(1)为底物,在其C-6位与多种仲胺进行Mannich反应,合成了8个未见文献报道的4’,7-二甲氧基金雀异黄酮Mannich碱衍生物2~9。将化合物1~9对人宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞(HCC1954)和人卵巢癌(SK-OV-3)细胞进行抗增殖活性测试,结果表明部分4’,7-二甲氧基金雀异黄酮Mannich碱衍生物具有一定的抗癌细胞增殖生物活性。

7-二氟甲氧基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素上调miR-26b对妊娠期糖尿病脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

目的探究7-二氟甲氧基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素(7-difluoromethoxy-5,4’-dimethoxygenistein,DFMG)对妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)肠系膜脂肪细胞摄取葡萄糖的影响。方法提取GDM孕妇肠系膜脂肪细胞,MTT检测不同浓度DFMG对脂肪细胞的毒性;液体闪烁仪检测脂肪细胞对[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖的摄取率;RT-PCR检测孕妇肠系膜脂肪细胞miR-26b及其下游靶基因PTEN m RNA表达变化;Western blotting检测IRS-PI3K/AKT-m GLUT4信号通路相关蛋白的表达。结果 DFMG对体外培养GDM孕妇肠系膜脂肪细胞无毒副作用,与GDM组相比,液体闪烁仪提示DFMG可显著促进GDM肠系膜脂肪细胞对[~3H]-2-脱氧-D-葡萄糖的摄取率(P<0.05)。RT-PCR提示DFMG可以显著上调GDM脂肪细胞mi R-26b表达(P<0.05),下调PTEN mRNA表达(P<0.05)。Western blotting提示DFMG可以下调PTEN蛋白表达(P<0.05),上调p-PI3K、p-AKT和mGLUT4蛋白表达(P<0.05)。结论 DFMG可能通过上调miR-26b表达,调节IRS-PI3K/AKT-GLUT4信号通路,调节GDM肠系膜脂肪细胞对葡萄糖的摄取率。

DFMG拮抗LPC诱导主动脉内皮细胞凋亡

目的研究7-二氟甲氧基-5、4’-二甲氧基金雀异黄素(7-difluoromethoxy-5,4’-dimethoxy-genistein,DFMG)对溶血性磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)诱导人主动脉内皮细胞(human aorta en-dothelial cells,HAEC)凋亡的影响。方法体外培养HAEC。Annexin V/PI染色流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率。ELISA法测定Caspase-3、8和9活性。Western blotting分析细胞色素c和死亡受体-4、-5表达。结果 LPC(10μmol/L)处理HAEC 24 h,细胞凋亡率为(31.6%±4.1%)(P<0.001)。DFMG预孵育降低LPC诱导HAEC细胞凋亡率,Caspase-3、-8和-9活化及细胞色素C和死亡受体-5表达(P<0.05)。结论 DFMG拮抗LPC诱导HAEC细胞凋亡作用与阻断LPC激活死亡受体和线粒体凋亡途径有关。

DFMG对内皮细胞COX-2表达和黏附功能的影响

目的 :观察7-二氟甲氧基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素(DFMG)对损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)中环氧化酶2(cyclooxygenase-2,C0X-2)蛋白表达的影响及内皮细胞的保护作用。方法 :TNF-α诱导建立人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)损伤模型,不同浓度的DFMG进行干预;流式细胞术检测细胞凋亡、Western Blot检测COX-2蛋白表达、ELISA检测E-选择素、单核趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的释放,蛋白定量分析法测定内皮细胞与单核细胞的黏附率。结果 :DFMG呈浓度依赖性阻断损伤的内皮细胞活性的下降、下调COX-2蛋白的表达、降低内皮细胞与单核细胞的黏附率。结论 :DFMG可能通过下调COX-2蛋白表达水平,从而减少单核细胞/内皮细胞黏附作用,减少炎症渗出,抑制炎症反应,保护血管内皮。

DFMG对TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L相互作用的影响

目的:观察7-二氟甲氧基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素(DFMG)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)损伤模型的保护作用,探讨其保护作用的发挥是否与抑制CD40/CD40L相互作用相关。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVE-12),20ng/mL TNF-α孵育诱导细胞损伤模型;加入不同浓度的DFMG,台盼蓝拒染法检测细胞活力、AnnexinⅤ-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡、流式细胞仪检测CD40/CD40L的表达。结果:DFMG呈浓度依赖性的升高TNF-α诱导的HUVEC-12细胞存活率;DFMG呈浓度依赖性的降低TNF-α诱导的HUVEC-12细胞凋亡;DFMG呈浓度依赖性降低CD40/CD40L表达。结论:DFMG保护TNF-α诱导的HUVEC-12细胞损伤,这种保护作用可能是通过抑制CD40/CD40L的表达发挥作用的。

DFMG对LPC诱导的人脐静脉内皮细胞的CD40/CD40L相互作用及E-选择素的释放的影响

目的:7-二氟甲氧基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素(7-difluoromethoxy-5,4'-dimethoxygenistein,dFMG)对溶血性磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)损伤模型的保护作用,探讨其是否通过抑制CD40/CD40L相互作用E-选择素的释放相关。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)。Annexin V/PI染色流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率,用流式细胞仪检测CD40/CD40L的表达,酶联免疫吸附法检测E-选择素的释放。结果:LPC(10μmol/L)处理HUVE-12(6h、12h、24h和48h),24h的细胞凋亡率为(30.98%±2,04%)(P<0.05)。DFMG预孵育降低LPC诱导HUVE-12的细胞凋亡率,CD40/CD40L的表达降低及E-选择素的释放减少(P<0.05)。结论:DFMG拮抗LPC诱导HUVE-12细胞凋亡作用与减少CD40的表达及E-选择素的释放有关。

DFMG调节TLR4信号通路对氧化损伤的内皮细胞诱导巨噬细胞增殖的影响

目的 :观察7-二氟甲氧基-5,4’-二甲氧基金雀异黄素(DFMG)对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)诱导的THP-1(人单核细胞系)源性巨噬细胞(MΦ)增殖的影响及探索其可能的发生机制。方法 :制备溶血性磷脂酰胆碱(LPC)氧化损伤HUVE-12与MΦ共培养模型,浓度梯度DFMG、TLR4特异性拮抗剂(CLI-095)、TLR4特异性激动剂(LPS)干预LPC氧化损伤HUVE-12与MΦ共培养;MTT法观察MΦ的增殖;western blot检测HUVE-12 TLR4蛋白的表达水平。结果 :LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞增殖,DFMG抑制LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞的增殖,上调TLR4表达进一步促进LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞的增殖,下调TLR4表达抑制LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞的增殖。结论 :DFMG可能通过下调LPC氧化损伤HUVE-12的TLR4蛋白表达水平,抑制炎症反应,从而抑制巨噬细胞增殖。

DFMG调节TLR4-MyD88信号转导对LPC诱导的巨噬细胞增殖的作用

目的:探索7-二氟甲氧基-5,4’-二甲氧基金雀异黄素(DFMG)对溶血性磷脂酰胆碱(LPC)处理巨噬细胞(MΦ)增殖活性的影响以及相关信号通路作用机制。方法:首先制备PMA诱导巨噬细胞与LPC诱导巨噬细胞增殖细胞模型,以及不同浓度DFMG孵育后用LPC诱导巨噬细胞增殖,用台盼蓝拒染法和CCK-8法分别检测细胞存活率和增殖活性。ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的表达,Western blot检测TRL4、MyD88蛋白表达。结果:1.用150nM PMA佛波酯(PMA)诱导分化为巨噬细胞百分率为(39.67±0.05)%,显著高于未处理组(0.55±0.19)%,用不同浓度LPC(3.0、10.0、30.0、100.0μM)孵育处理巨噬细胞,台盼蓝拒染法和CCK-8法结果测得巨噬细胞增殖率和存活率与空白对照组相比下降均具有统计学意义。故选LPC30.0μM作为LPC处理巨噬细胞模型的最佳造模浓度。2.LPC能诱导巨噬细胞培养液中TNF-α的分泌增加,上调TLR4、MyD88蛋白的表达。3.DFMG以时间和浓度依赖方式增高LPC处理巨噬细胞增殖活性,降低LPC处理巨噬细胞培养液TNF-α浓度,DFMG能拮抗LPC上调巨噬细胞TLR4、MyD88蛋白的表达作用。结论:DFMG能增强LPC对巨噬细胞增殖活性的减弱和降低TNF-α分泌作用与其抑制TLR4-MyD88信号转导相关。