7-脱氢胆固醇还原酶在人类肿瘤中致癌作用的泛癌分析

探究DHCR7(7-脱氢胆固醇还原酶)基因在肿瘤里的表达概况,以及临床预后关联情况。方法 采用数据库(TCGA和GEO)的数据研究DHCR7在癌组织和癌旁组织里的表达差异情况,采用GEPIA2数据库里分析DHCR7不同表达情况肿瘤患者的OS(总生存率)和DFS(无病生存率);使用cBioPortal工具分析肿瘤的蛋白质结构的改变频率、突变位点信息及类型、copy number changes (CNA)和3D (three-dimensional)结构数据;使用TIMER2数据库分析DHCR7的表达与所有TCGA数据库中肿瘤免疫浸润的关系。结果 与正常组织相比,DHCR7的表达水平在大多数人类肿瘤中增加,在几种原发性肿瘤组织中DHCR7的蛋白有更高的表达;DHCR7表达的升高与CESC、HNSC、BLCA和UVM癌症的的不良预后有关;DHCR7的最高改变频率在食管腺癌患者中约为22%,在不同类型的遗传改变中,扩增是最常见的类型;免疫细胞浸润分析结果显示DHCR7的表达与HNSC中CD8+ T细胞的浸润之间负相关。结论 DHCR7的表达水平在大多数人类肿瘤中升高,并且和临床不良预后紧密相关,DHCR7的表达的升高影响了肿瘤中免疫细胞的浸润,因此其可能作为肿瘤治疗新靶点。

肝细胞癌中7-脱氢胆固醇还原酶表达的临床意义

目的:探讨7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)在肝细胞癌(HCC)组织中的表达水平及临床意义。方法:采用多中心样本(n=41)分析HCC与正常肝组织中DHCR7的差异性表达。通过Wilcoxon秩和检验和标准化平均差(SMD)评估肿瘤组和对照组之间DHCR7表达水平的差异。使用总体受试者工作特征曲线(sROC)评估DHCR7在癌症中的临床价值。结果:相较于正常肝细胞,在HCC组织中观察到DHCR7 mRNA表达升高(P <0.05)。DHCR7 mRNA在HCC组织中的过表达有潜力作为鉴别肿瘤与正常组织的指标[总敏感性(Se)=0.60,总特异性(Sp)=0.81,曲线下总面积(AUC)=0.77],表明DHCR7具有用于辅助诊断HCC的潜力。结论:对比健康肝脏,HCC中的DHCR7 mRNA体现较高表达,而DHCR7蛋白也具有高表达的趋势,DHCR7可能成为HCC的潜在标志物。

7-脱氢胆固醇对白细胞介素-4诱导RAW264.7巨噬细胞M1/M2型极化的影响

目的研究7-脱氢胆固醇(7-DHC)对白细胞介素-4(IL-4)诱导的RAW264.7巨噬细胞M1/M2型极化的影响。方法体外培养RAW264.7巨噬细胞,分为M0组(RAW264.7巨噬细胞)、M2组(巨噬细胞M2型)。M2组以IL-4诱导极化,在诱导极化的同时分别予以0、5、10、20μg/mL 7-DHC处理(即M2组、M2+5μg/mL 7-DHC组、M2+10μg/mL 7-DHC组、M2+20μg/mL 7-DHC组)。CCK-8法检测7-DHC对M2组巨噬细胞的增殖情况。荧光定量PCR分别检测巨噬细胞M1型标志分子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞分化抗原86(CD86)及M2型标志分子甘露糖受体(MR)、Ⅰ型精氨酸酶(ArgⅠ)的mRNA表达情况。酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)的水平。结果7-DHC浓度分别为0、5、10、20μg/mL时,对巨噬细胞M2型均无增殖或抑制作用(P>0.05)。与M0组比较,M2组iNOS及CD86的mRNA表达明显降低,MR、ArgⅠ的mRNA及IL-10的表达明显增加(P<0.05);与M2组比较,7-DHC其他浓度干预组iNOS、CD86的mRNA及IL-6的表达明显增加,MR、ArgⅠ的mRNA及IL-10的表达明显降低(P<0.05),且5、10、20μg/mL 7-DHC处理组呈剂量依赖性。结论7-DHC能够调节IL-4诱导的RAW264.7巨噬细胞M2型极化,并促进巨噬细胞M2型向巨噬细胞M1型转化。

生物法合成7-脱氢胆固醇研究进展

化学合成维生素D3工艺虽然成熟,但有着本身难以解决的问题。酶促生化反应具有专一性强、条件温和、反应速度快、效率高等特点。本文主要阐述以生物合成维生素D3的原体-7-脱氢胆固醇几种方法,一种是以角鲨烯、醋酸盐为底物,通过动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇;另一种是利用螃蟹许多器官的酶能将胆固醇转化成维生素D3的原体-7-脱氢胆固醇。同时还论述了7,8-胆固醇脱氢酶的克隆与表达,就有关的研究进展、重要基因的克隆表达、技术的应用前景进行了综述。

虾Y-器官7、8-脱氢酶转化胆固醇为7-脱氢胆固醇研究

[目的]以虾Y-器官微粒体7、8-脱氢酶催化胆固醇,制备7-脱氢胆固醇。[方法]通过单因素试验,研究影响转化反应的各种因素。[结果]将摘除眼柄的刀额新对虾(Metapenaeus ensis)Y-器官,匀浆、离心制备的微粒体酶液,于22℃与胆固醇避光反应6 h,可以积累相对较多的7-脱氢胆固醇。[结论]该研究为利用虾Y-器官7、8-脱氢酶转化胆固醇为7-脱氢胆固醇奠定基础。

7-脱氢胆固醇的合成工艺研究

胆固醇在石油醚中与醋酸酐反应得到胆固醇醋酸酯,经2,4,4,6-四溴-2,5-环己二烯酮处理得到7-溴化胆固醇酯,再用2,4,6-三甲基吡啶脱溴得到7-脱氢胆固醇醋酸酯,最后水解得到目标产物7-脱氢胆固醇.对上述四步反应条件进行了研究,第三步以2,4,4,6-四溴-2,5-环己二烯酮为溴化剂,具有选择性高、反应条件温和、产率高等特点.四步总收率(以胆固醇计)达68.9%.

RP-HPLC同时检测发酵液中7-脱氢胆固醇与胆固醇的研究

7-脱氢胆固醇是维生素D3的直接前体,试验研究了RP-HPLC同时检测发酵液中7-脱氢胆固醇及其前体胆固醇的方法和条件。应用Waters sunfire C18(Φ416×150 mm,5μm)色谱柱,乙腈∶异丙醇=80∶20(v∶v)为流动相,1.0mL/min流速,38℃柱温,于波长210 nm紫外检测器检测。在此条件下,7-脱氢胆固醇和胆固醇呈现较好的分离和重现性,其保留时间分别为8.248min和9.598min左右,最低检测浓度分别为8mg/L和10 mg/L,平均回收率分别为99.53%和97.67%。

7-脱氢胆固醇还原酶基因沉默对体外培养小鼠腭突融合的影响

目的通过RNA干扰抑制7-脱氢胆固醇还原酶(Dhcr7)基因在培养腭突中的表达,研究Dhcr7基因对腭突融合的影响。方法根据C57BL/6J小鼠Dhcr7基因特异性的siRNA序列构建pAdTrack-CMV-siDhcr7,阳性克隆的pAdTrack-CMV-siDhcr7质粒进行体外重组,筛选出抗卡那霉素的重组腺病毒p Ad Easy-1-siDhcr7质粒,酶切后制备腺病毒载体DNA转染胚胎腭突。取妊娠13.5 d的小鼠胚胎腭突共30对随机分为3组,每组10对。正常对照组、空白腺病毒对照组和实验组均用不含胆固醇培养基培养腭突,其中空白腺病毒对照组加入空白腺病毒,实验组加入Dhcr7siRNA腺病毒。培养48 h后固定腭突并提取Dhcr7 mRNA和蛋白,采用扫描电子显微镜(SEM)观察腭突融合情况,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分析Dhcr7 mRNA和蛋白的含量。结果 SEM检测显示,正常对照组和空白腺病毒对照组在培养48 h时两侧腭突融合,形成连续的上腭;而实验组几乎没有生长,两侧腭突之间有很宽的裂隙。RT-PCR和Western blot检测显示,实验组Dhcr7 mRNA和蛋白表达与正常对照组和空白腺病毒对照组相比均明显减少,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Dhcr7基因在腭突中的表达下调后,腭突融合失败,说明Dhcr7基因在腭突正常发育融合中起一定的作用。

液态乳中胆固醇、7-脱氢胆固醇及25-羟基胆固醇的同步测定方法

试验优化了液态乳胆固醇的皂化条件(皂化时间、温度和皂化试剂添加量),采用高效液相色谱法同时测定乳品中胆固醇、7-脱氢胆固醇和25-羟基胆固醇的含量。结果表明,1 m L液态乳最佳皂化条件:80℃下2.0mL 2 mol/L KOH皂化20 min,液态乳的胆固醇含量为10.824 mg/100g;采用Eclipse plus C18 (4.6 mm×250mm,5μm)色谱柱,以甲醇为流动相,流速0.8 mL/min,在205 nm和227 nm两个波长下分离3种胆固醇,分离效果较好。胆固醇、7-脱氢胆固醇和25-羟基胆固醇分别在0.0967～0.9959 mg/mL、0.0120～0.2011 mg/mL和0.1237～0.1998 mg/mL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9999,R2=0.9996,R2=0.9992);胆固醇、7-脱氢胆固醇和25-羟基胆固醇的精密度试验RSD分别为0.619%,3.562%,1.696%;稳定性试验RSD分别为0.545%,1.248%,2.798%;重现性试验的RSD为1.105%,1.446%,5.284%;回收率分别为99.5%,67.6%,47.4%。该方法操作简单,试剂用量小,耗时短,结果准确可靠,可用于液态乳中胆固醇的准确测定。此外,本试验应用该方法测定了13种液态乳,发现除了母乳样品中含有少量的7-脱氢胆固醇和25-羟基胆固醇外,其它奶制品中均未检测出。

7-脱氢胆固醇还原酶在腭突发育中的表达

目的:观察7-脱氢胆固醇还原酶(Dhcr7)基因在小鼠胚胎腭突发育中表达量的变化。方法:在体视显微镜下取E13.5、E14.5和E15.5的小鼠胚胎的腭突,免疫组织化学(IHC)观察Dhcr7蛋白在腭突中的表达定位,逆转录式聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测Dhcr7 mRNA的表达变化,Western blot法检测蛋白的表达变化。结果:Dhcr7主要表达在胚胎腭突间充质细胞(EPM);E13.5、E14.5和E15.5 mRNA相对表达量(Dhcr7/β-actin)分别是0.692±0.084、0.595±0.051和0.369±0.061;E13.5与E14.5比较,P>0.05;E13.5、E14.5分别与E15.5比较,P<0.01;蛋白相对表达量(Dhcr7/GAPDH)分别是0.857±0.008、0.840±0.005和0.300±0.007,E13.5与E14.5相比,P>0.05;E15.5分别与E13.5和E14.5相比P<0.01。结论:Dhcr7在腭突发育中的关键阶段有表达,并且表达量与其生长发育有密切关系。

7-脱氢胆固醇还原酶与2型糖尿病的研究进展

糖尿病是一种代谢性疾病,主要表现为糖脂代谢异常。深入研究影响糖尿病患者糖脂代谢的变化因素,有十分重要的临床意义。7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)作为胆固醇生物合成最后一步的酶类,在胆固醇和维生素D的合成间起重要的调节开关作用。血脂异常及血浆维生素D水平低下均与2型糖尿病的发生、发展密切相关,但人类血清DHCR7水平在2型糖尿病患者中的变化及其与血脂、维生素D之间的关系却鲜有报道。

7-脱氢胆固醇的合成工艺改进

以胆固醇为原料,经酰化、氧化、还原、水解以及消除等5步反应合成维生素D3原7-脱氢胆固醇,总收率42%,其结构经1H NMR和13C NMR确证。研究了酰化反应、氧化反应、还原反应和消除反应条件对收率的影响。

胆固醇制备7-脱氢胆固醇的研究进展

7-脱氢胆固醇作为制备维生素D_3及其衍生物的关键中间体,主要通过胆固醇烯丙位取代消除反应来合成。综述了7-脱氢胆固醇几种代表性的合成方法,并对合成方法进行了分析总结。

7-脱氢胆固醇还原酶在上皮性卵巢癌细胞系SKOV3中的表达及其作用机制

目的:探讨7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)在上皮性卵巢癌细胞系SKOV3中的表达及其作用机制。方法:聚合酶链反应(PCR)检测DHCR7抑制剂(AY 9944)是否诱导增加SKOV3细胞中DHCR7基因的表达水平。细胞计数试剂盒(CCK-8)、细胞划痕试验检测AY 9944对SKOV3细胞活性及迁移能力的影响。通过蛋白质印迹法(Western blot)探究AY 9944对SKOV3细胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)通路的影响。Graph Pad Prism 8.0.1统计软件进行统计处理。结果:1.AY 9944能够诱导DHCR7基因表达上调(t=8.485,P<0.05)。2.AY 9944使SKOV3细胞活性明显低于对照组(12 h F=35.22,24 h F=20.34,48 h F=37.56,P<0.05),细胞迁移能力低于对照组(对照组24 h划痕恢复64.50%,48 h为81.14%,加药组24 h划痕恢复30.08%,48 h时为32.79%,P<0.05)。3.SKOV3细胞中DHCR7表达上调后细胞Akt蛋白水平无明显变化(t=0.527,P>0.05),磷酸化Akt(p-Akt)水平低于对照组(t=4.297,P<0.05);PI3K水平低于对照组(t=4.779,P<0.05),CCND1 mRNA表达水平降低(t=9.095,P<0.05),表达低于对照组。结论:AY 9944抑制SKOV3细胞增殖和迁移能力。AY 9944抑制DHCR7酶活性,同时诱导DHCR7基因的表达,其作用机制可能是AY 9944抑制PI3K/Akt/Cyclin D1信号通路,减少CCND1的表达。

人工酵母后鲨烯路径基因对7-脱氢胆固醇合成的影响

酵母内源后鲨烯路径中的固醇类物质,是异源甾体类药物合成的重要前体。为了通过微调后鲨烯路径,与异源模块进行适配,以期达到提高异源甾体类化合物表达的目的,以维生素D3的直接前体—7-脱氢胆固醇(7-DHC)的合成为例,首先在固醇C-24甲基转移酶(ERG6)缺失的酿酒酵母BY4742中,通过导入人源固醇C-24还原酶DHCR24,并过表达截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶t HMGR,获得可以合成7-DHC的人工酵母。在此基础上,将后鲨烯路径分割并构建成ERG1、ERG7、ERG11、ERG24-25-26-27和ERG2-3这5个模块,分别在所构建的7-DHC合成菌株中过表达。通过GC-TOF/MS分析7-DHC以及后鲨烯路径中相关代谢中间体的含量,并结合主成分分析发现,过表达不同后鲨烯模块会引起后鲨烯路径上固醇组分的变化而最终影响7-DHC的产量:与出发菌株相比,过表达ERG11模块会显著强化其他固醇物质到酵母固醇的转化;而过表达ERG2-3模块则会减少鲨烯的积累,同时显著增加羊毛固醇及其之后的固醇组分的含量,并获得迄今为止7-DHC在微生物中摇瓶水平的最高产量。因此,对ERG11和ERG2-3的表达优化对7-DHC的合成以及后鲨烯路径代谢流的强化起到了显著的作用,是后续优化人工7-DHC合成酵母的潜在靶点。为研究后鲨烯路径与其他异源甾体合成模块间的适配,提供了可供参考的案例。

小干扰RNA抑制胚胎腭突间充质细胞7-脱氢胆固醇还原酶基因的表达

目的观察小鼠胚胎腭突间充质（EPM）细胞中7-脱氢胆固醇还原酶基因（Dhcr7）的表达，筛选出针对EPM细胞Dhcr7的最有效小干扰RNA（siRNA）序列。观察RNA干扰（RNAi）沉默Dhcr7的表达后，对EPM细胞增殖的影响。方法化学合成3条针对Dhcr7mRNA的siRNA，阳性脂质体介导转染EPM细胞。荧光显微镜观察转染效率，Westernblot法检测Dhcr7蛋白表达变化，噻唑蓝（MTT）检测沉默后增殖率的变化。结果siRNA转染效率为72．6％。3条siRNA对EPM细胞Dhcr7基因表达都有抑制作用，siRNA-3抑制作用最明显，达60．2％，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。Dhcr7沉默后EPM细胞增殖抑制率为56．4％，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论筛选出针对EPM细胞Dhcr7最有效的siRNA序列。siRNA可抑制EPM细胞Dhcr7基因表达，Dhcr7表达降低可抑制EPM细胞增殖。

DHCR7基因在胃癌中的表达及其与免疫相关基因的关系

目的探究7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)基因在胃癌中的表达及其与免疫相关基因的关系。方法使用UALCAN、TIMER数据库分析DHCR7基因在不同类型肿瘤中的表达情况。使用GEPIA、TCGA、GEO数据库分析DHCR7基因在胃癌中的表达。Kaplan-Meier Plotter数据库分析DHCR7基因表达与胃癌患者预后的相关性。通过cBioPortal数据库找出与DHCR7共表达的基因,并展示这些基因中相关系数比较高的基因。对胃癌中与DHCR7表达正负相关的基因进行基因本体分析(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析,首先分析DHCR7基因与CD8^(+)T细胞以及招募CD8^(+)T细胞相关趋化因子的相关性;其次分析DHCR7基因与免疫激活相关基因的相关性;最后分析DHCR7表达与胃癌患者临床病理学特征的关联。结果DHCR7基因在大多数肿瘤类型中均有高表达趋势。DHCR7基因在胃癌中的表达高于正常胃黏膜。Kaplan-Meier Plotter数据库中201790-s-at芯片结果显示高表达DHCR7组患者生存期较短。与DHCR7负相关基因的GO、KEGG通路富集分析主要富集在免疫相关功能和信号通路上,DHCR7与CD8^(+)T细胞、招募CD8^(+)T细胞相关的趋化因子以及免疫激活基因都具有负相关性。DHCR7高表达与胃癌患者年龄呈正相关。结论DHCR7在胃癌组织中呈高表达,高表达DHCR7患者预后不良,DHCR7基因能够影响胃癌免疫微环境,有望成为胃癌免疫治疗的新靶点。

高效液相色谱法测定血清卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性的建立

目的建立高效液相色谱法(HPLC)测定血清卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)活性的方法,观察LCAT活性与动脉粥样硬化性心血管病(CVD)传统危险因素的关系。方法选用7-脱氢胆固醇和1,2-二癸酰基甘油-3-磷酸(10∶0 PC)作为LCAT的反应底物,加入LCAT激活肽(LAP642),制备脂质体;在冰水浴中将500μL脂质体与10μL血清混合,37℃温育1 h;提取脂质,HPLC测定反应后7-脱氢胆固醇及其酯之比,计算LCAT活性。用所建方法测定120例健康志愿者血清的LCAT活性,分析其与CVD危险因素的关系。结果 7-脱氢胆固醇、10∶0 PC(物质的量的比为1∶8.5)与LAP642组成的脂质体制备简单、性质稳定。当温育时间0~8 h、血清量0~20μL时,LCAT活性与变量线性相关;平均批内不精密度(CV)和总CV分别小于1.76%、3.11%。方法比对结果显示,所建方法与ELISA测定的LCAT质量和内源底物法测定的LCAT活性显著正相关(P<0.01)。120例样本LCAT活性与体质量指数(BMI)、三酰甘油(TG)等呈正相关(P<0.05);与载脂蛋白AⅠ(apo AⅠ)(P<0.05)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)(P<0.01)等呈负相关。结论建立了HPLC测定LCAT活性的外源底物法,所建方法简便、精密、可靠,结果不受反应底物影响,为脂代谢机制研究和CVD危险分析提供了新的方法学基础。

胆固醇7,8位脱氢酶的表达及催化活性研究

果蝇的neverland基因是胆固醇7,8位脱氢的重要酶基因。为了探究其在胆固醇脱氢反应中的催化机制,将neverland分别克隆至表达载体p IEx-6及p XY212,再转染导入S2细胞并电转化到S.cerevisiae W303-1A中表达。Western blot结果证实NVD蛋白在重组S2细胞及S.cerevisiae W303-1A中实现了表达。胆固醇转化实验经HPLC分析发现,重组S2细胞可以将胆固醇转化为7-脱氢胆固醇,而重组S.cerevisiae W303-1A并不能实现胆固醇的7,8位脱氢。此外,在重组S.cerevisiae W303-1A和S2细胞的破碎液共同转化胆固醇及NVD体外转化实验中也未发现产物7-脱氢胆固醇的生成。实验结果显示,neverland基因在S2细胞中具有生物活性而在S.cerevisiae中没有生物活性,表明它在胆固醇脱氢时需要其它的伴侣蛋白协助,实验结果为进一步研究其催化机制提供了理论基础。

基于生物信息学构建膀胱癌预后风险预测模型及临床价值分析

目的:基于生物信息学分析,探讨7-脱氢胆固醇还原酶(7-dehydrocholesterol reductase,DHCR7)、非红细胞血影蛋白β2(non-erythrocytic 2,SPTBN2)在膀胱癌(bladder cancer,BLCA)中的表达特征,并分析其作为BLCA不良预后预警模型的临床应用价值。方法:通过基因表达谱数据动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)网站评估DHCR7、SPTBN2在BLCA中的表达特征;Kaplan-Meier Plotter在线网站分析DHCR7和SPTBN2表达与BLCA患者总生存率的关系。进一步,选取2018年1月至2019年12月在本院收治的78例BLCA为研究对象,免疫组织化学法检测组织中DHCR7、SPTBN2的表达并分析与BLCA临床病理特征的关系;多因素Logistic回归模型对BLCA不良预后的危险因素进行分析,构建预警模型并转化为风险评分系统;受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线和Hosmer-Lemeshow(H-L)检验评估模型的诊断效能和拟合度;10-折交叉法对模型内部和外部进行验证。结果:GEPIA在线网站提示,BLCA组织中DHCR7和SPTBN2表达水平高于正常对照组(P<0.05);DHCR7和SPTBN2在BLCA患者Ⅳ期中的表达较Ⅱ期增加(P分别为0.00191,0.0062);随着DHCR7和SPTBN2表达水平增加,患者的生存率降低(Logrank P分别为0.0031,0.0015)。DHCR7、SPTBN2表达在不同TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移的患者中比较,差异有统计学意义(χ^(2)=6.167,5.080,5.092;χ^(2)=8.621,4.807,4.734,均P<0.05);且TNMⅢ-Ⅳ期、低分化程度、有淋巴结转移以及DHCR7、SPTBN2高表达是BLCA不良预后的危险因素(P<0.05)。构建模型组ROC曲线下面积(AUC)为0.889,H-L检验拟合较好(χ^(2)=6.0899,P=0.2976);验证组AUC为0.883,H-L检验拟合较好(χ^(2)=9.2649,P=0.0990)。结论:基于DHCR7和SPTBN2构建的BLCA不良预后风险预警模型诊断效能较好,可为BLCA不良预后预测提供重要的参考价值。