紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的分离及7-表-紫杉醇的转化研究

目的探索从云南红豆杉树皮提取物中分离紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇3种纯化合物以及7-表-紫杉醇转化成紫杉醇的高效方法。方法用乙酸叔丁酯为单流动相,硅胶为填充柱的正相色谱系统分离。使用碱性氧化铝,在40℃对7-表-紫杉醇进行催化而转化成紫杉醇。结果与结论分离得到紫杉醇、三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇3个纯化合物.7-表-紫杉醇转化率可达30％。

10-去乙酰基-7-表紫杉醇转化为紫杉醇的研究(英文)

目的将天然紫杉烷类物质10 -去乙酰基- 7 -表紫杉醇高效地转化为抗癌药物紫杉醇。方法首先将10 -去乙酰基 7 -表紫杉醇中的2′OH选择性保护、7 -OH乙酰化、去保护3步一锅反应获得7- 表紫杉醇,再在DBU的催化下差向异构化为紫杉醇。结果本方法以10 -去乙酰基 7 -表紫杉醇为起始原料,以4 0 %的总收率制备得到紫杉醇。结论建立了一条将天然紫杉烷类物质以较高的化学选择性以及良好的收率转化为紫杉醇的途径。

7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的优化试验研究

在寻找东北红豆杉(Taxus cuspidata)中的抗癌的活性物质过程中,一种亲水性紫杉醇衍生物7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇被筛选出来。目的是优化并建立红豆杉中7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的提取工艺及鉴定,本文以使用RP-HPLC测定的7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇含量为指标,采用正交试验法对提取过程中乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取次数(C)、提取时间(D)4因素进行优化。结果从红豆杉中提取7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的最主要影响因素是乙醇浓度及固液比,高浓度、高用量有利于提取;提取时间和次数也极为重要,单因素实验结果以2h/次和提取2次为最佳。结论N9(A3B3C2D1)、N8(A3B2C1D3)为优化选出的7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇最佳提取工艺条件。

工业色谱法分离制备7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇酶解产物10-去乙酰紫杉醇

基于工业色谱法分离制备抗癌药物紫杉醇的半合成前体10-去乙酰紫杉醇(10-DAP)。7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇(10-DAXP)在我国特有红豆杉品系(中华红豆杉)枝叶中含量丰富,以其为原料可制备紫杉醇最理想的半合成前体——10-DAP。本研究以部分纯化后的7-木糖基-10-去乙酰紫杉烷为原料,通过β-木糖苷酶水解该粗提物中的主要成分10-DAXP及其两个微量类似物7-木糖基-10-去乙酰三尖杉宁碱(10-DAXC)和7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇C(10-DAXP C),脱去其C-7位上的木糖基,水解产物采用大孔吸附树脂吸附,正相快速柱分离和反相制备色谱分离,可获得高纯度的目标物10-DAP,产物纯度为96%,整个工艺的收率大于75%。该方法适合以10-DAXP为原料大规模制备紫杉醇的半合成前体化合物10-DAP,为工业化生产紫杉醇开辟了一条新途径。

大孔吸附树脂提取7-木糖-10-去乙酰紫杉醇酶解产物10-去乙酰紫杉醇

本研究利用大孔树脂富集7-木糖10-去乙酰紫杉醇的酶解产物10-去乙酰紫杉醇。首先以10-去乙酰紫杉醇(10-DAT)绝对含量为指标,通过HPLC测定比较HP20、XAD4、XAD16、XAD1600四种大孔树脂对10-去乙酰紫杉醇的吸附与解吸性能力,筛选出最佳树脂XAD1600进行实验。最佳的吸附解吸条件为:树脂柱高径比10∶1,吸附流速20mL/min,吸附量23.85mg/mL,以6倍柱床体积的90%乙醇为洗脱液,洗脱流速20mL/min。经XAD1600型树脂富集后10-去乙酰紫杉醇回收率达96.5%,含量20.5%。且树脂柱重复使用3次后,其吸附能力仅降低5%。

氧化铝催化7-表-紫杉醇转化为紫杉醇的机理探索

在碱性氧化铝作用下 ,云南红豆杉浸膏中 7 表 紫杉醇被催化转化为紫杉醇。该异构化反应是由氧化铝表面L酸中心、碱中心的协同作用而催化 ,在室温条件下就可进行 ,氧化铝表面酸碱中心的种类和强度都将影响反应进行的程度 。

利用天蓝色链霉菌转化7-木糖紫杉烷的研究

紫杉醇是目前临床治疗癌症的一线化疗药物,资源紧张,价格昂贵。7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(7-XDT)在红豆杉中含量可达紫杉醇的10倍,脱除木糖基后生成的10-脱乙酰紫杉醇(10-DAT)经乙酰化可生成紫杉醇。通过木聚糖平板对不同菌株进行筛选,从52株供试微生物中,发现27株在木聚糖平板上生长良好。经转化实验筛选,发现一株天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor YUCM 410115)具有转化7-XDT为10-脱乙酰紫杉醇的能力。菌体细胞经破碎离心后,沉淀及上清液均无转化反应出现,而发酵液的硫酸铵沉淀物则可以转化7-XDT生成10-DAT,表明该菌株能产生一种胞外紫杉醇-7-木糖苷酶,发酵液酶活为6 268U。首次发现天蓝色链霉菌能够产生紫杉醇-7-木糖苷酶,为7-XDT转化生产紫杉醇提供了新的酶源。

美洲大蠊肠道产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株的筛选及鉴定

旨在筛选美洲大蠊肠道具有产7-木糖紫杉烷糖基水解酶性能的内生菌,并对其进行生物学鉴定。以实验室保存的178株美洲大蠊肠道内生菌为研究对象,采用刚果红透明圈法和荧光显色法筛选产木聚糖酶菌株,进一步利用薄层色谱法筛选产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株。在此基础上,选取一株高产7-木糖紫杉烷糖基水解酶菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定,并采用高效液相色谱法测定其对7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇的转化率。结果显示,178株美洲大蠊肠道内生菌中有55株菌产木聚糖酶,其中8株链霉菌和2株贪铜菌可产生7-木糖紫杉烷糖基水解酶。高产菌株WA11-2-9经形态学特征、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定为Streptomyces enissocaesilis。WA11-2-9可将7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇转化为10-去乙酰巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰紫杉醇,主要产物10-去乙酰紫杉醇的转化率为21.52%。美洲大蠊肠道内生菌WA 11-2-9(GenBank Accession:MZ411692)具有分泌7-木糖紫杉烷糖基水解酶的能力,它为后续生物转化制备紫杉醇奠定了坚实基础。

耐热β-木糖苷酶的可溶性表达及其应用

紫杉醇作为一种具有突出药用价值的天然抗癌药物,其在红豆杉属植物中的含量极少,且已有的紫杉醇制备方法难以满足商业需求,因此酶法制备紫杉醇的研究受到越来越多的关注。通过β-木糖苷酶水解紫杉醇类似物7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(7-XDT)得到10-去乙酰基紫杉醇(10-DT),再进一步被乙酰基转移酶催化变成紫杉醇,此双酶催化反应为紫杉醇的制备提供了一个可靠方法。以嗜热菌Thermotoga petrophila DSM 13995来源的β-木糖苷酶Tpexyl3为研究对象,利用重组酶Tpexyl3催化7-XDT制备10-DT。为了提高重组β-木糖苷酶Tpexyl3在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达量,对6种商业化的分子伴侣蛋白进行了筛选。结果表明:分子伴侣蛋白dnaK-dnaJ-grpE能显著提高Tpexyl3在大肠杆菌中的可溶性表达量;在以质量分数1%的麦芽糊精作为碳源的富集肉汤(TB)培养基中,不添加诱导剂,32℃下发酵48 h,重组酶Tpexyl3的表达量可达190 U/mL,较原始重组质粒在溶菌肉汤(LB)培养基中的表达量(6.81 U/mL)提高了27.9倍;在重组酶Tpexyl3加酶量250 U/mL、7-XDT质量浓度500 mg/L、pH 5.5、80℃下反应4 h,可生成162 mg/L的10-DT,物质的量转化率为45.59%。

MSPD-HPLC法分析云南红豆杉中的10-DAB Ⅲ和紫杉醇

为建立云南红豆杉(Taxus yunnanensis)中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)和紫杉醇(Taxol)的分析方法,该研究采用基质固相萃取-高效液相色谱分析(MSPD-HPLC)对云南红豆杉中的10-DABⅢ及Taxol进行定量分析,探究硅胶、佛罗里硅土、酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝、C_(18)、C_(18)-ME、C_(18)-G1、C_(18)-HC、Diol、Xamide、Xion共12种样品预处理分散剂及各种分散剂的质量、洗脱剂的种类、洗脱剂的浓度、洗脱剂体积对两种成分分析的影响,并对优化后的条件进行方法学验证,同时与超声提取、热回流提取预处理方法进行比较分析证明其有效性。结果表明:(1)12种固相分散剂中,碱性氧化铝具有良好的目标化合物萃取物检出量,并且当碱性氧化铝与样品的质量比为3∶1、6 mL甲醇为洗脱剂洗脱时,10-DABⅢ和Taxol的萃取检出量较高。(2)建立的云南红豆杉枝叶中10-DABⅢ和Taxol的分析方法具有良好的线性关系(r≥0.9999),10-DABⅢ和Taxol的检出限和定量限分别介于0.0239~0.0301μg·mL^(-1)和0.142~0.178μg·mL^(-1)之间;各目标分析物平均加样回收率在93.6%~109.0%之间。(3)比较分析显示,3种方法对2种紫杉烷类化合物的萃取检出量基本无差别,但MSPD法溶剂消耗少、操作简单,分析时间短,净化效率高,可应用于云南红豆杉原料的快速分析。该研究以碱性氧化铝为分散剂应用于云南红豆杉紫杉烷类化合物的萃取,建立了快速、高效的云南红豆杉中10-DABⅢ和紫杉醇的分析方法,为云南红豆杉中的紫杉烷类化合物的定量分析提供了依据。

7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱的HPLC分析方法及其溴化产物的抗癌活性研究(英文)

分别在C18柱和MetachemTaxsil 3紫杉醇专用柱上研究了云南红豆杉粗提物中紫杉醇(1)、三尖杉宁碱(2)、7 表 10 去乙酰基紫杉醇(3)和7 表 10 去乙酰基三尖杉宁碱(4)的反相色谱行为.在MetachemTaxsil 3紫杉醇专用柱上,水:乙腈(54:46)的流动相使这四种色谱行为相近的化合物获得了基线分离.使用溴化法处理含有(2)和(4)的红豆杉粗提物,通过分离纯化得到了二溴 7 表 10 去乙酰基三尖杉宁碱的两个非对映异构体(5和6).体外活性实验结果表明,5和6对于人乳腺癌(MCF 7)、人肺癌(A549)和人卵巢癌的体外毒性比紫杉醇略强.

不同产地及生长年限曼地亚红豆杉中10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇量的比较分析

目的分析和比较5个不同产地、不同生长年限曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类活性成分量的差异。方法利用甲醇和三氯甲烷混合液超声浸提后再用甲醇溶解得到样品溶液;通过高效液相色谱法测定和比较10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB Ⅲ)、三尖杉宁碱和紫杉醇量及3者总量。结果不同产地、不同生长年限的曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类及其总量间存在极显著性差异(P<0.01);10-DAB Ⅲ、三尖杉宁碱、紫杉醇和3种紫杉烷类总量相对较高的3个产地及生长年限分别依次为HK4>SM3>SM2、ZL3>HK4>ZL4、ZL3>SM2>HK4、HK4>ZL3>ZL6。除10-DAB Ⅲ与三尖杉宁碱量间不存在显著的相关性外,其余各成分间均存在极显著的正相关关系(P<0.01);不同产地及生长年限间紫杉醇与3种紫杉烷类总量间呈现出同升同降的趋势;聚类分析表明福建福州产区紫杉醇量具有一定的特殊性,而河南开封3种紫杉烷类总量有别于其他产区。结论产地和生长年限对曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类量的变化具有明显的影响,可以通过对生物合成途径进行调控,继而达到获得更多紫杉醇原料药的目的。

10-去乙酰基紫杉醇配伍紫杉醇对两种肿瘤细胞生长抑制的作用

目的:观察紫杉醇配伍紫杉烷类成分10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)对A549、LS174T肿瘤细胞株的体外抑制作用。方法:采用A549、LS174T肿瘤细胞株进行MTT细胞毒性实验,观察10-DAT单独给药、10-DAT配伍紫杉醇对两种肿瘤细胞的生长抑制作用。结果:10-DAT单独使用时对LS174T细胞有一定的生长抑制作用,对A549则无抑制生长作用;但配伍紫杉醇反而会拮抗紫杉醇对A549和LS174T细胞的毒性作用。结论:10-DAT单独使用对LS174T细胞具有生长抑制作用,在高浓度下会拮抗紫杉醇对LS174T和A549细胞的细胞毒性,其原因可能源自两个化合物对微管蛋白的竞争性结合,确切机制有待进一步深入研究。

UPLC-MS/MS法研究紫杉醇及其注射液的杂质谱

本文采用超高效液相-三重四级杆质谱联用技术（UPLC-MS/MS）对国内多个生产企业的紫杉醇原料与注射液的有关物质及杂质谱进行了深入研究,对紫杉醇及杂质的质谱裂解规律进行了分析与总结。采用对紫杉醇乙醇溶液进行酸、碱、氧化、光照等强制降解实验对紫杉醇原料与注射液中的降解杂质进行分析,该方法模拟了紫杉醇注射液的处方,但避免了其中辅料聚氧乙基蓖麻油的基质干扰,降解杂质基本涵盖了紫杉醇注射液中所有的杂质。本文共推定了杂质10个,分别为三尖杉宁碱（cephalomannine,1）、7-表-10-脱乙酰紫杉醇（7-epi-10-deacetylpaclitaxel,2）、7-表紫杉醇（7-epi-paclitaxel,3）、巴卡汀（baccatinⅢ,4）、侧链乙酯化合物（ethyl ester side chain,5）、7-表巴卡汀（7-epi-baccatinⅢ,6）、10-脱乙酰紫杉醇（10-deacetylpaclitaxel,7）、紫杉醇C3-C11桥联异构体（paclitaxel isomer,C3-C11 bridge,8）、紫杉醇异构体（paclitaxel isomer,9）和N-苯甲酰-（2R,3S）-3-苯基异丝氨酸[N-benzoyl-（2R,3S）-3-phenylisoserine,10],其中1~3为工艺杂质,紫杉醇乙醇溶液酸降解产生的主要杂质为3~7,碱降解产生的主要杂质为2~7、10,氧化降解产生的主要杂质为7,高温降解产生的主要杂质为3~5、7,光照产生的主要降解杂质为2~5及本文首次报道的9,原料直接光照产生的主要杂质为8,该研究成果对于国内紫杉醇及其注射液的工艺研究、质量控制与评价有较大的意义。

曼地亚红豆杉中紫杉醇等与产地因子的相关性

从国内8个不同产地采集曼地亚红豆杉Taxus media枝条和林下土壤,利用高效液相色谱(HPLC)法测定了紫杉醇(taxol)和10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatin,10-DAB)质量分数,用常规方法测定了土壤的矿质元素及肥力结构等。结果表明:不同产地的曼地亚红豆杉紫杉醇和10-DAB质量分数差异很大,紫杉醇有随北纬纬度增高而递减的趋势;紫杉醇和10-DAB与多数土壤因子相关性不显著,其中:紫杉醇与有机质呈显著正相关,与北纬纬度呈显著负相关,10-DAB与土壤矿质元素钴和锰质量分数呈显著负相关;紫杉醇与10-DAB之间不存在相关性(r=-0.197);用多元逐步回归分析建立了紫杉醇质量分数的回归方程。推测:曼地亚红豆杉的紫杉醇及其衍生物质量分数变化规律与红豆杉属其他种相似,受生长必需环境因子影响明显。

正相色谱和反相色谱法分离提纯东北红豆杉中紫杉醇和三尖杉宁碱

以东北红豆杉树叶为原料,采用正相色谱和反相色谱法分离提纯了紫杉醇和三尖杉宁碱。反相色谱中使用了一种新颖的高分子填料。东北红豆杉枝叶经过一次正相色谱分离后,再经两次反相色谱分离,分离得到两种白色针状固体。经1H NMR和13C NMR测试表明,两种物质分别为紫杉醇和三尖杉宁碱,纯度达到98%以上,产率分别为树叶干重的0.0022%和0.0018%,回收率大于70%。

红豆杉浸膏在氧化铝催化下紫杉醇的生成研究

目的 :研究在氧化铝层析初分离红豆杉浸膏中紫杉醇增量的来源。方法 :采用C18 硅胶反相层析、氧化铝层析及硅胶层析等方法对物料进行处理 ,HPLC分析紫杉醇的含量。结果 :紫杉醇增量主要来源于红豆杉浸膏中 7 表 紫杉醇的碱性氧化铝催化下的异构化。结论 :优化 7 表 紫杉醇的异构化条件 ,可以增加 7 表 紫杉醇向紫杉醇的转化。

HPLC法测定红豆杉中紫杉醇及同系物的含量

建立了HPLC法测定红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（简称10-DABⅢ）、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱和紫杉醇的含量。采用二种流动相系统分别测定南方红豆杉枝叶中四种成分，以较大极性的甲醇-水（43：57）流动相系统测定10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ，以乙腈-水-甲醇（27：44：29）为流动相测定三尖杉宁碱和紫杉醇，采用Nova—Pak C18反相柱，流速为1mL／min，柱温35℃，紫外检测波长为227nm。10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱和紫杉醇的线性范围（n=5）分别为0．01～0．5μg（r=0．9998），0．01～1μg（r=0．9999），0．015～0．5μg（r：0．9990），0．01～0．5μg（r=0．9992）；样品用丙酮和水浸提，体积比为60：40，回收丙酮后，用二氯甲烷萃取得到上述四种成分。本实验方法操作简便，结果准确，重现性好，可作为不同地区红豆杉的质量控制方法之一。

紫杉醇生产中资源的综合利用——天然紫杉烷合成紫杉醇工艺的探讨

从红豆杉植物中提取分离抗癌药物紫杉醇的副产物——紫杉醇-7-木糖苷,经高碘酸钠的氧化、三氯化铈进行保护羟基、乙酰化、脱去保护剂四步反应得紫杉醇,总收率27.4%,达到了资源综合利用的目的。

固相萃取高效液相色谱法快速测定红豆杉枝叶中的3种紫杉烷类化合物

研究了用固相萃取预分离高效液相色谱法测定红豆杉枝叶中紫杉醇、三尖杉宁碱和7 表紫杉醇的方法。其中,固相萃取使用了一种新型的PRP 6高分子树脂。红豆杉枝叶经干燥粉碎后用甲醇提取,提取液用PRP 6固相萃取小柱预分离,以V(乙腈)∶V(水)=45∶55为流动相,用C18色谱柱进行分离,紫外检测器227nm测定上述3种紫杉烷类化合物,该方法加标回收率为91%～98%。此法可以快速准确的测定不同红豆杉枝叶中上述3种紫杉烷类化合物。