电针对大鼠失神经腓肠肌中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/70KD核糖体蛋白S6激酶信号通路的影响

目的探讨电针延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩的可能机制。方法雄性Sprague-Dawley大鼠18只随机分为假手术组(n=6)、模型组(n=6)和电针组(n=6)。后两组钳夹伤右侧坐骨神经制备失神经骨骼肌萎缩模型。造模后第2天,电针组电针右侧足三里穴和环跳穴,共2周。取双侧腓肠肌称重,计算腓肠肌湿重比;HE染色测量肌纤维横截面积和直径;Western blotting检测大鼠骨骼肌中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR (p-mTOR)、70KD核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)和磷酸化p70S6K (p-p70S6K)蛋白表达;实时定量聚合酶链反应检测大鼠骨骼肌中mTOR、p70S6K基因表达。结果与假手术组相比,模型组和电针组腓肠肌湿重比、肌纤维横截面积及直径显著下降(P<0.001),电针组明显高于模型组(P<0.01)。与假手术组相比,模型组右侧腓肠肌mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K蛋白表达升高(P<0.01);电针组高于模型组(P<0.05)。与假手术组相比,模型组右侧腓肠肌mTOR、p70S6K基因表达升高(P<0.05);电针组高于模型组(P<0.05)。结论电针可延缓失神经骨骼肌萎缩,可能与激活mTOR/p70S6K信号通路,影响骨骼肌蛋白合成有关。

牛脑液泡型质子泵70kD和33kD亚基基因的表达

已分离了编码牛脑液泡型质子泵的７０ｋＤ亚基的ｃＤＮＡ，利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了７０ｋＤ亚基的编码片段，同时直接从牛脑ｃＤＮＡ库中得到了３３ｋＤ亚基的编码片段．分别将相应片段连接到ＰＥＴ载体上完成７０ｋＤ和３３ｋＤ亚基基因在大肠杆菌中的表达．ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析表明７０ｋＤ和３３ｋＤ亚基基因均得到明显表达．

自身核抗原U1SnRNP70kD多肽分子中U1RNA结合功能区的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究采用逆转录－ＰＣＲ技术克隆自身核抗原Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ多肽分子中Ｕ１ＲＮＡ结合功能区（Ｕ１ＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，Ｕ１ＢＤ）的ｃＤＮＡ，经ＤＮＡ测序证实以后定向插入原核表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ，进而导入大肠杆菌中表达重组蛋白。免疫印迹法研究表明：９６％（４８／５０）的抗Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗体阳性血清能够识别该重组蛋白，证实Ｕ１ＢＤ重组蛋白具有Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗原性，而且Ｕ１ＢＤ是Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ多肽上主要抗原表位区域，能够被大多数抗Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗体阳性血清识别。这为今后对Ｕ１ＢＤ抗原表位精确定位，分析特定抗原表位与疾病的相关性以及制备重组抗原用于临床检测等研究奠定基础。

稳定表达未折叠蛋白反应荧光报告基因的SH-SY5Y细胞系建立

目的通过稳定表达70 kD热休克蛋白(HSP)4重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的SH-SY5Y细胞系,直观实时反映细胞内未折叠蛋白反应(UPR)的变化。方法以SH-SY5Y细胞的cDNA为模板,克隆HSPA4,并连接EGFP。将HSPA4-EGFP连接入慢病毒载体中,慢病毒转染SH-SY5Y细胞。使用3μg/ml嘌呤霉素处理细胞1个月,筛选得到HSPA4-EGFP稳转系。通过实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)、Western印迹、共聚焦显微镜检测等方法,证实HSPA4-EGFP稳转系能有效且实时反映UPR的变化。结果扩增到HSPA4-EGFP,并成功构建HSPA4-EGFP稳定表达的UPR报告系统。QPCR检测表明,构建的报告系统可以指示UPR。在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内绿色EGFP的点状分布,其能够反映UPR错误折叠蛋白的多少及分布,分别加入UPR激活剂、抑制剂后,细胞内绿色EGFP的点状分布明显增多和减少,差异有统计学意义(P<0.05)。Western印迹检测到细胞中HSPA4-EGFP融合蛋白表达条带。结论成功构建HSPA4-EGFP稳转系,能够直观实时反映UPR变化,为深入研究UPR及其相关疾病(包括老年性疾病)提供工具。

氟对暴露工人外周血淋巴细胞HSP70含量的影响

本文用斑点杂交方法检测了氟暴露工人外周血淋巴细胞７０ＫＤ热休克蛋白（ＨＳＰ７０）含量。结果显示：氟暴露工人外周血淋巴细胞ＨＳＰ７０含量显著增加。提示氟对暴露工人外周血淋巴细胞合成ＨＳＰ７０具有一定的诱导作用。

特异性下调热休克蛋白70对肾癌细胞凋亡及迁移的影响

目的特异性下调肾癌细胞内热休克蛋白70(HSP70)的表达,观察其对肾癌细胞生物学特性的影响,初步探讨其可能机制,为肾癌的治疗探寻新的途径。方法使用针对HSP70的mRNA序列设计的小干扰RNA转染肾癌细胞Caki-1,观察转染后HSP70的mRNA及蛋白表达水平的变化;采用流式细胞术和Transwell小室检测HSP70下调后对肾癌细胞凋亡和迁移能力的影响,检查细胞凋亡和迁移相关蛋白caspase-9剪切体、Bcl-2、Bax和Vimentin的表达变化。结果使用小干扰RNA转染后,Caki-1细胞HSP70的mRNA和蛋白水平均明显下调;特异性下调HSP70表达的实验组Caki-1细胞的凋亡率[(13.21±0.33)%]和迁移抑制率[(43.86±3.02)%]较阴性对照组[分别为(8.85±0.69)%、(4.04±0.72)%)]明显上调(P<0.001);实验组细胞的Vimentin和Bcl-2表达下调,而caspase-9剪切体和Bax表达上调。结论特异性下调HSP70在肾癌细胞内的表达可诱导肾癌细胞凋亡并抑制其迁移能力,HSP70具有作为肾癌治疗靶点的重要研究价值。

SeO_3^（2－）及SeO_3^（2－）和半胱氨酸或还原型谷胱甘肽联用对牛脑V

Ｓｅ_３^（２－）对牛脑Ｖ型质子转运ＡＴＰ酶复合体活力呈现明显的抑制作用。这种抑制作用具有对剂量和预保温时间的依赖关系，且不被稀释效应所恢复，但过量的ＤＴＴ可去除这种抑制作用。半胱氨酸对这种抑制作用呈双功能效应。低浓度时促进抑制作用，高浓度时部分恢复抑制作用。还原型谷胱甘肽与半胱氨酸有类似效应。但促进抑制作用没有半胱氨酸强，而恢复抑制作用却较半胱氨酸强。ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影图谱表明，ＳｅＯ_３^（２－）和半脱氨酸优先结合在７０ｋＤ亚基上。并且验证了ＡＴＰ酶复合体的－ＳＨ基和ＳｅＯ_３^（２－）及半胱氨酸的－ＳＨ基以－Ｓ－Ｓｅ－Ｓ－键相连接。根据上述结果，讨论了７０ｋＤ亚基的－ＳＨ基及其相关的结构域涉及到ＡＴＰ酶的活性中心，７０ｋＤ亚基可能是ＡＴＰ酶复合体的水解活性亚基。

麻醉对大鼠应激反应的影响

用40、42、44℃分别处理清醒状态和麻醉状态大鼠30min，于正常饲养条件下恢复24h后，检测其肝脏热休克蛋白70（HSP70）的表达差异及酸性和中性蛋白水解酶活性变化。结果表明，当热休克温度为40-44℃时，清醒状态大鼠肝脏的HSP70合成能力逐渐下降，而麻醉大鼠肝脏HSP70合成能力逐渐增加，在42℃热休克条件下，麻醉状态大鼠肝脏的酸性蛋白水解酶活性最强，在44℃热休克条件下，清醒状态大鼠肝脏的酸性蛋白水解酶活性最强，在40-44℃热休克条件下，麻醉状态和清醒状态大鼠肝脏的45kD中性蛋白水解酶活性与对照相似，但40kD的中性蛋白水解酶活性随热休克温度升高而降低，另外，40℃热休克诱导麻醉状态大鼠肝脏出现一个高活性的35kD中性蛋白水解酶，根据实验结果推测，麻醉状态大鼠肝脏的热耐受性大于清醒大鼠，大鼠的热休克反应受整体水平和细胞水平的双重调控，并涉及除HSP70合成以外的其他生化活动。