C基因沉默的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株反向遗传学系统的建立

为建立小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)反向遗传学体系,本研究以PPRV Nigeria75/1疫苗株基因组序列为基础,PCR分7个片段扩增病毒基因组,运用重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)在3’端引入锤头状核酶(Hammerhead ribozyme,HamRz)、5’端引入丁型肝炎病毒核酶(Hepatitis D virus ribozyme,HdvRz)和T7终止子,构建PPRV全长cDNA感染性克隆质粒pBluescript SK-PPRV,进一步构建C基因沉默的病毒全长cDNA感染性克隆染质粒pBluescript SK-PPRVΔC。pBluescript SK-PPRVΔC、pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L共转染BSR T7/5细胞,48 hpt后收集细胞反复冻融上清液感染山羊子宫内膜上皮细胞(GEECs),盲传3代,拯救重组病毒命名为rPPRVΔC。重组病毒感染GEECs细胞中RT-PCR扩增出病毒N、P和部分L基因(L2)片段,Western blot检测到N蛋白表达、C蛋白未表达,IFA也检测到N蛋白表达,成功建立了PPRV Nigeria75/1株反向遗传学体系。研究结果为PPRV新型标记疫苗的研制及C蛋白致病机理研究奠定了基础。