草鱼CD8α和CD207的表达及抗细菌免疫的功能研究

为探讨树突状细胞(Dendritic cells,DCs)表面重要的表型分子CD8α和CD207在草鱼(Ctenopharyngodon idella)DCs抗细菌免疫应答中的作用,实验从草鱼DCs的cDNA中扩增CD8α和CD207胞外区,构建重组表达质粒pET-32a-CD8α/CD207,并转化到感受态细胞Transetta(DE3),表达纯化后制备CD8α和CD207多克隆抗体。利用qPCR、Western Blot及流式细胞术揭示草鱼CD8α和CD207在抗细菌免疫过程中发挥的功能。结果显示,制备的草鱼CD8α和CD207多克隆抗体既可以识别原核表达的重组蛋白,也能识别鱼体内和培养细胞的内源性蛋白。从功能上看,灭活嗜水气单胞菌处理草鱼DCs后,在24h内,CD8α和CD207的表达量均有显著上调(P<0.05);且CD8α和CD207分子在草鱼DCs呈递抗原刺激混合淋巴细胞增殖这一过程中发挥重要作用。因此,草鱼DCs表现出与哺乳动物相似的保守免疫表型和功能,研究结果为阐明草鱼DCs介导的适应性免疫调节机制奠定基础。

麻鸭和樱桃谷鸭的CD3ε、CD4、CD8α基因ORF克隆及序列分析

【目的】分析比较中国部分品种鸭的CD3ε、CD4和CD8α基因ORF序列,为研究CD3ε链、CD4和CD8α链的结构和功能及其抗体的应用提供依据。【方法】利用RT-PCR,对麻鸭、樱桃谷鸭的CD3ε、CD4和CD8α基因ORF序列克隆测定,应用Clustal(X1.83)和DNAstar生物学软件分别与GenBank上公布的北京鸭CD3ε(AF378704)、CD4(AF378701)和CD8α(AF378373)基因ORF序列进行序列分析。【结果】麻鸭、樱桃谷鸭、北京鸭CD3ε和CD4基因ORF序列及所编码的氨基酸同源性为99%;北京鸭和麻鸭CD8α基因ORF序列同源性为99%,与樱桃谷鸭的同源性为95%。麻鸭和北京鸭CD8α基因ORF序基因编码的氨基酸完全一致,与樱桃谷鸭的CD8α存在16处位点差异,其中胞外区有15个氨基酸的差异,使亲水性、抗原性以及此区域位于蛋白质表面的可能性都有明显差异。从遗传发生树得出樱桃谷鸭、北京鸭、麻鸭CD3ε和CD4的ORF序列相互之间的遗传关系近;樱桃谷鸭、麻鸭和北京鸭CD8α基因ORF序列之间的遗传关系较远。【结论】樱桃谷鸭、北京鸭、麻鸭CD3ε和CD4的ORF序列遗传变异性低,樱桃谷鸭与麻鸭和北京鸭CD8α基因ORF之间具有较高遗传变异性。

CD8α在雄性牦牛主要免疫器官的分布

CD8α是细胞毒性T淋巴细胞重要的表面标志,广泛参与对MHCⅠ分子递呈抗原的识别和信号传递,对细胞免疫应答和防御机制至关重要。本研究采用RT-PCR方法克隆牦牛(Bos grunniens)CD8α编码区,通过实时荧光定量PCR、Western blot及免疫组织化学SP法,检测成年雄性牦牛的主要免疫器官(胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结)内CD8αmRNA及蛋白的表达。RT-PCR反应扩增得到牦牛CD8αmRNA序列编码区长为729bp,编码243个氨基酸,与黄牛有较高的同源性。实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示,CD8αmRNA及蛋白在各免疫器官中均有表达,且在胸腺表达量最高,在脾与血结表达量相似,二者表达量均高于肠系膜淋巴结(P<0.01)。免疫组织化学结果显示,CD8α阳性T细胞在胸腺皮质、髓质均有分布;在脾主要分布在动脉周围淋巴鞘和红髓髓索;肠系膜淋巴结及血结内,CD8α阳性细胞主要分布在淋巴小结周边及髓索。结果提示,牦牛胸腺的CD8α阳性T淋巴细胞输出量可能影响次级淋巴器官内T细胞含量;血结可能与淋巴结及脾一样,在细胞免疫发挥同等重要的作用。这些数据将为适时免疫、致病机理和疾病防治等研究提供新的资料。

转导反向6A8α-甘露糖苷酶cDNA对抗Fas抗体诱导Jurkat细胞凋亡的影响

用梯形DNA电泳与Gimsa染色研究人T细胞瘤细胞株Jurkat在转导编码人 6A8α 甘露糖苷酶基因的反向cDNA后 ,对抗Fas抗体诱导凋亡敏感性的变化 ,并用间接免疫荧光染色 (流式细胞仪 )检测细胞表面Fas分子的表达。结果表明 ,抗Fas抗体诱导细胞 2 4h后 ,野生型及转导空载载体的Jurkat细胞出现明显的梯形DNA ,两者之间无明显差异 ,但转导反向 6A8cDNA的细胞未见明显的梯形DNA。Gimsa染色结果显示转导反向 6A8cDNA的Ju rkat细胞中凋亡细胞数明显减少 ,而转导空载载体则无影响。Jurkat细胞为Fas(CD95 ,Apo 1)全阳性细胞 ,转导反向 6A8cDNA或空载载体对Fas表达阳性率与Fas表达强度无明显影响。以上结果提示 ,转导编码 6A8α 甘露糖苷酶基因的反向cDNA使人T细胞株Jurkat对抗人Fas抗体诱导的凋亡作用产生耐受。

中国部分地方品种鸡CD4和CD8α基因cDNA的克隆与序列分析

用Trizol分别提取4～6周龄白莱航鸡、狼山鸡、大骨鸡、北京油鸡、仙居鸡、茶花鸡、固始鸡和隐性白羽鸡胸腺细胞的总RNA，再用Oligo-dT纤维索富集mRNA后，用RT-PCR分别扩增出鸡CD4和cD8α基因cDNA。将PCR产物克隆进T载体后测序。序列分析显示不同品种鸡的CD4 cDNA序列完全一致；中国地方品种鸡与国外品种的白莱航鸡、RPL7系鸡在CD8α胞外区有6～13个氨基酸的差异，仙居鸡与其他5个中国地方品种鸡在CD8α胞外区有4～5个氨基酸的差异，狼山鸡、北京油鸡和隐性白羽鸡CD8α cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列完全一致。这些结果表明，中国地方品种鸡CD4基因序列高度保守；中国地方品种鸡与国外品种鸡的CD8α cDNA序列之间具有遗传多态性，而中国地方品种鸡之间CDSα cDNA序列遗传多态性低，为进一步研究CD4分子和CD8α链的结构和功能提供了条件。

NOD小鼠CD_8α^+抗原基因克隆载体的构建及其相关蛋白在树突状细胞中的表达

目的:构建NOD小鼠CD8α+抗原基因重组慢病毒载体,探讨其在树突状细胞(DCs)中的表达,阐明1型糖尿病(T1DM)的发病机理。方法:设计CD8α+基因特异性引物,从NOD小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增CD8α+基因,与质粒载体pCDF1-MCS2-EF1-COPGFP进行连接重组,经过转化、筛选、鉴定和序列测定后,应用Western blotting法检测CD8α+基因的表达。应用Nanofectin脂质体转染试剂将含有目的基因的质粒转染HEK293细胞,进行重组慢病毒载体包装,将包装后的重组慢病毒颗粒感染DCs,采用Western blotting法检测CD8α+蛋白的表达。结果:成功构建了NOD小鼠CD8α+抗原基因的重组质粒载体,重组表达载体经转染HEK293细胞获得了重组病毒的原液,重组病毒扩增后感染DCs,免疫荧光下可见DCs内含有绿色荧光蛋白(GFP)表达。结论:NOD小鼠CD8α+抗原基因重组病毒载体构建成功,且有相关蛋白表达。

东北白鹅CD8α基因的克隆及其胞外区基因的表达与抗血清的制备

根据GenBank公布的绿头鸭CD8α(AF378373)基因序列设计引物,通过RT-PCR获得东北白鹅CD8α基因。根据测序结果设计特异性引物,克隆得到东北白鹅CD8α胞外区基因,并在pET-30a(+)及pET-28a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导重组蛋白质获得表达,Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白质,以纯化的重组蛋白质(pET-30a-CD8ex)为免疫原制备兔抗鹅CD8α胞外区抗血清。I-ELISA、Western blot分析表明抗血清可特异识别分离获得的东北白鹅外周血T淋巴细胞与重组蛋白质(pET-28a-CD8ex),间接免疫荧光试验证实,纯化的抗血清可特异性识别瞬时真核表达的鹅CD8α胞外区蛋白质。利用激光共聚焦显微镜观察到分离获得的鹅外周血淋巴细胞的细胞膜处出现明显的荧光信号。本研究结果说明制备的抗血清可作为鹅CD8+T淋巴细胞的检测试剂。

6A8α-甘露糖苷酶表达对人鼻咽癌细胞CNE-2L2端粒酶活性和端粒长度的影响

探讨端粒长度与端粒酶活性在人鼻咽癌细胞CNE 2L2恶性行为改变前后的变化 ,建立研究恶性行为改变与端粒长度与端粒酶活性间关系的细胞模型。与 6A8α 甘露糖苷酶表达正常的CNE 2L2细胞 (野生型细胞W ,转导空载体的细胞M及转导无关DNA片段的细胞S)相比 ,6A8α 甘露糖苷酶表达低下的细胞 (AS)接种裸鼠皮下后的肿瘤性生长受抑。用TeloTAGGGTelomereLengthAssayKit及TelomerasePCRELISAKit分别测定端粒长度及端粒酶活性 ,用RT PCR方法分析端粒重复序列结合因子 (TRF)的转录水平。见AS细胞的端粒明显缩短 (6 78Kb ,W细胞为8 4 0Kb ,M细胞为 8 34kb ,S细胞为 9 5 6kb) ,但端粒酶活性及端粒重复序列结合因子 1和 2 (TRF 1和 2 )的转录水平未见改变。实验表明 ,恶性行为降低的CNE 2L2细胞的端粒变短 ,但与端粒酶活性及TRF 1 2无关 ,提示在CNE 2L2细胞中可能存在着端粒酶及TRF 1 2以外的调节端粒长度的机制。

CD8α^+树突状细胞研究进展

根据细胞表面CD8α的表达差异,小鼠脾脏中树突状细胞(DC)可以分为2种,即CD8α-DC和CD8α+DC,二者功能迥异。本文回顾了近年来CD8α+DC的研究动向,重点分析了CD8α+DC的在肿瘤免疫、移植免疫和生殖免疫等中的作用。

暗纹东方鲀CD8α基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备

CD8是与I型主要组织相容性复合体(MHC I)结合,是T细胞表面受体(TCR)的共受体,也是T淋巴细胞表面的重要标志物。该研究报道了暗纹东方鲀胸腺等组织中克隆获得CD8αcDNA序列及其相应的基因组序列。克隆到的cDNA序列全长1 061 bp,包含1个657 bp的开放读码框(ORF),编码218个氨基酸;其对应的基因组序列为1 533 bp,包含5个内含子和6个外显子。生物信息学分析表明,D8α蛋白质序列由信号肽、胞外可变区、铰链区、跨膜区和胞内区5部分组成。胞外区的可变区和铰链区部分各有两个高度保守的半胱氨酸残基,可能参与链内和链间二硫键的形成。氨基酸序列多重比对表明,暗纹东方鲀与其他鱼类的CD8α,特别是与鲽形目鱼类具有较高的同源性。为进一步研究暗纹东方鲀CD8的生物学功能,构建了表达CD8α成熟肽胞外区的重组质粒,诱导表达出重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫大白兔,制备了抗血清。经间接ELISA法检测抗体效价表明,获得了高效价的特异性暗纹东方鲀CD8α抗体,为进一步研究CD8在鱼类淋巴细胞进化和适应性免疫中的作用奠定了基础。

8α-OH马尾杉碱B的结构鉴定——NMR谱分析及密度泛函理论研究

从千层塔中分离得到了一新生物碱,图谱分析不能确定其相对构型,为此我们运用量子化学密度泛函方法对其进行了NMR理论计算.核磁共振理论模拟表明,8α-OH马尾杉碱B的化学位移值与实验值吻合得非常好.同时,理论研究与COSY,NOESY谱图的对照,以及偶合常数的分析、取代基效应的分析都进一步确证了该化合物的结构.此外我们的研究还表明,NMR的量子化学计算为天然产物的结构鉴定提供了一种新的工具.

胞膜(Ecto)-6A8α-甘露糖苷酶

68Aα-甘露糖苷酶是本实验室克隆的cDNA(GenBank的登记号为AF044414)编码的一个新的人α-甘露糖苷酶[1].该cDNA长3300bp,其开放阅读框架编码1062个氨基酸的蛋白质.蛋白质的1028～1048aa为穿膜区.6A8α-甘露糖苷酶属工型穿膜蛋白.6A8基因定位于第15号染色体q11～13区.

三黄鸡CD8α/βcDNA克隆与表达及其多克隆抗体的制备

为了获得鸡CD8α/β蛋白及其多克隆抗体,进一步研究其结构与功能,本实验从三黄鸡cDNA文库中克隆了其CD8α/β胞外区片段,构建了pQE30/ChCD8α/β原核表达系统,并经诱导表达、亲和层析纯化,获得了纯化的重组蛋白(rChCD8α/β),然后用rChCD8α/β分别免疫Balb/c小鼠制备了其多克隆抗体。结果表明:本实验克隆的ChCD8α长483 bp、编码161个氨基酸、可在E.coliJM109中高效表达,蛋白质分子质量为24.0 ku,表达量占菌体蛋白量的25.0%,由该蛋白质所制备的多克隆抗体抗rChCD8α的ELISA效价为1∶1 024 000;另外,克隆的ChCD8β长447 bp,编码149个氨基酸,蛋白质的分子质量为18.5 ku,表达量占菌体蛋白量的20.0%,抗rChCD8β多克隆抗体ELISA效价为1∶64 000。本实验所得鸡CD8α/β的多克隆抗体将用于四聚体研究。

编码鸡CD8α链无信号肽基因片段的克隆与表达

应用RT-PCR技术,通过自行设计的1对引物以ConA诱导的鸡胸腺淋巴细胞RNA为模板,扩增出编码鸡CD8α链的无信号肽基因片段,大小为651 bp。该片段经酶切初步鉴定后,被插入pMD18-T载体进行测序,发现与已发表的鸡CD8α链基因序列的同源性达98%。进一步将该片段插入原核表达质粒,构建pGEX-4T-1-CD8α,并转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导培养并提取表达蛋白质。在SDS-PAGE电泳图谱中可见大小约为50 000的蛋白带,表明所克隆的编码鸡CD8α链无信号肽基因片段在原核细胞中得到表达。

鲤主要免疫器官CD4L、CD8α和CD8β表达细胞的分布特征

自1975年在硬骨鱼类中发现T细咆存在的证据以来，单克隆抗体技术、免疫组化和原位杂交等技术的应用，使鱼类T细胞及其亚群和功能的研究成为可能。从20世纪80年代起，人们开始尝试通过各种方法例如用胸腺细胞、多聚甲醛同定的胸腺细胞（DLT15）、胸腺细咆膜（WCL9）、肠自细胞膜（WCL38）免疫小鼠进而制备抗鱼类T细胞的单克隆抗体。

北京鸭CD8α分子克隆与表达及其多克隆抗体制备

为了探讨鸭CTL免疫与病毒关系,本文用PCR技术从鸭cDNA文库中克隆了其CD8α基因(DuCD8α)。将DuCD8α成熟肽cDNA插入表达载体pQE30、构建了E.coliJM109(pQE30/DuCD8α)原核表达系。经诱导表达、蛋白纯化,制备了鼠抗DuCD8α多克隆抗体。结果表明DuCD8α成熟肽长645 bp,编码214个氨基酸。与已报道的DuCD8α在氨基酸水平上的同源性高达99.0%。SDS-PAGE证实重组DuCD8α(rDuCD8α)在JM109工程菌中的表达量可达15%。纯化的rDuCD8α分子量为26 kDa。ELISA结果显示鼠抗rDuCD8α多克隆抗体效价为1∶1 280 000。

6A8α-甘露糖甘酶的基因克隆、表达与功能研究

糖蛋白中的糖链在细胞-细胞、细胞-基质及细胞-分子间信息交通起重要作用.糖链可以N-连接方式(连接于蛋白质中由天冬酰氨酸、除脯氨酸外的任意氨基酸、丝氨酸/苏氨酸组成的序列子中的天冬酰胺)或O-连接方式(连接于蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸)与蛋白质相连.N-连接与O-连接均需要一系列酶的催化.这些酶的识别与特性研究有助于对蛋白质糖基化机制与糖链功能的了解.

鸡CD4和CD8α基因cDNA的克隆及其真核表达质粒的构建

用Trizol提取6周龄白莱航鸡胸腺组织的总RNA,再用Oligo-dT纤维素富集mRNA后,用RT-PCR分别扩增出鸡CD4和CD8α基因cDNA。PCR产物切胶回收后连入T载体,测序正确后再连入pcDNA3.1(+)。将重组质粒pcDNA3.1-CD4和pcDNA3.1-CD8分别转染COS-7细胞,用已知的抗鸡CD4和CD8的单克隆抗体检测到转染细胞中CD4和CD8α分子的表达,这说明构建的真核表达质粒正确,为下一步用DNA免疫方法研制抗鸡CD4和CD8的单克隆抗体以及研究鸡CD4和CD8分子的结构和功能打下基础。

CD8α^+树突状细胞介导的抗原交叉提呈作用与调控的研究进展

主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)分子提呈外源性抗原的方式称为抗原的交叉提呈作用,亦可启动CD8^+T细胞反应。小鼠淋巴组织包含一类表达CD8α以及其他特殊表面分子的树突状细胞(DC),该CD8α^+DC通过特殊的抗原摄取和加工处理方式对细胞相关抗原和可溶性抗原进行更高效的交叉提呈作用。我们主要总结了CD8α^+DC介导的抗原交叉提呈作用的细胞内机制、作用及调控的研究进展。

6A8α-甘露糖苷酶表达减弱和表达正常鼻咽癌细胞间的差异基因表达

目的发现因转导反义6A8cDNA致恶性生物学行为减弱的人鼻咽癌细胞CNE-2L2(AS)和野生型细胞(W)间的差异表达基因。方法用DNA微列阵方法比较AS细胞和W细胞基因表达的差异。用Northern印迹和RT-PCR验证所得结果的可靠性。结果与W细胞相比,AS细胞有34个基因的表达上调,有42个基因的表达下调。其表达增强可能对肿瘤恶性行为有抑制作用的基因有P130mRNAfor130Kprotein、TGF-betaIIRalpha、GABBR1、TGFBR1、TNFAIP1、STANIN、E-CADHERIN、CTNNA1、CTNNA2、RFX2及TMPO等,其表达减弱可能对肿瘤恶性行为有抑制作用的基因有CD44、NDRG1、TGFB1、RPS5、LEGUMAI、CBS、CD59及SNRPA1等。Northern印迹和RT-PCR验证了DNA微列阵方法检测的结果。结论与W细胞相比,AS细胞有34个基因表达上调,有42个基因表达下调,某些基因表达的改变可能与AS细胞恶性生物学行为的减弱相关。