代谢改造大肠杆菌合成8-异戊烯基山奈酚

8-异戊烯基山奈酚(8-prenylkaempferol,8-pk)是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗癌等药理活性。目前8-pk的生物合成主要通过植物来源的异戊烯基转移酶(prenyltransferases,PTs)催化山奈酚(kaempferol,Kae)实现。然而植物源的PTs自身含有的信号肽会极大阻碍其在原核生物中异源表达和高效催化,且催化途径中前体物质二甲基烯丙基焦磷酸盐(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)的供给不足严重限制了8-pk的生物合成产量。该研究以大肠杆菌(Escherichia coli)为底盘细胞,通过强化前体DMAPP供应和截短异戊烯基转移酶信号肽实现了8-pk的高效合成。首先,在E.coli BL21(DE3)中游离表达了淫羊藿来源的异戊烯基转移酶(EkF8DT),并引入异戊烯醇利用途径提升了EkF8DT的前体DMAPP的供应,8-pk产量达到2.14 mg/L。随后,通过AlphaFold2预测了EkF8DT的结构,将EkF8DT N端截短60个氨基酸时8-pk产量最高,达到6.46 mg/L。通过将EkF8DT的N端融合蛋白质标签以及优化发酵条件产量达到24.28 mg/L,最终在5 L发酵罐中8-pk产量达到44.33 mg/L,这是目前报道的较高水平。该研究为8-pk等类黄酮异戊烯基化的高效生物合成提供了策略。

8-异戊烯基山柰酚研究进展

8-异戊烯基山柰酚是常见的异戊烯基取代黄酮。近年来关于其化学研究、制备方法、药理活性研究均取得了重要进展。药理研究发现其具有广泛的药理活性,包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗骨质疏松、抗老年痴呆、降血糖、心血管保护、雌激素样作用等,为8-异戊烯基山柰酚的临床应用提供了丰富的研究资料。为了更好地对8-异戊烯基山柰酚的研究开发提供参考,本文基于前期研究的文献资料,综述了8-异戊烯基山柰酚的性质、波谱学数据、植物分布、制备方法、生物活性等方面的研究进展,并对8-异戊烯基山柰酚研究的发展方向作了展望。

8-异戊烯基柑橘素促进体外培养成骨细胞成熟矿化的研究

研究8-异戊烯基柑橘素对体外培养大鼠颅骨成骨细胞(rat skull osteoblasts,ROB)的分化成熟及生物矿化的影响.取新生大鼠颅骨多次酶消化法得到成骨细胞,培养于含10%FBS的MEM培养液中,3天后首次换液,待细胞铺满皿底传代培养.以碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)为检测指标,96孔板梯度筛选作用最佳浓度,在最佳浓度作用并成骨性诱导培养的第3、6、9、12天测ALP活性、钙盐沉积量;第12天进行ALP和钙化结节组织化学染色及计数;成骨性诱导后不同时间点提取Total RNA,RT real-time PCR法检测成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、成骨相关转录因子Osterix、Runx-2和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的基因表达情况;成骨性诱导的第4、8、12天裂解获得细胞总蛋白,蛋白质印迹法检测人Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)的蛋白质表达量.研究结果表明:1×10-6 mol/L能显著促进成骨细胞的成熟分化,表现为提高ROB的ALP活性、促进钙盐沉积、增加钙化结节数量;提高bFGF、IGF-1、Osterix、Runx-2和BMP-2 mRNA表达水平;促进COL-Ⅰ的合成.由此可知终浓度为1×10-6 mol/L 8-异戊烯基柑橘素能显著促进ROB的分化成熟及生物矿化,证明8-异戊烯基柑橘素能促进成骨细胞的分化成熟及生物矿化,作为促进骨修复和抗骨质疏松的有效成分具有较大的药用价值.

8-异戊烯基柑橘素促进体外骨髓基质干细胞成骨性分化的研究

目的研究8-异戊烯基柑橘素对体外培养大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的增殖与成骨性分化的影响。方法取大鼠股骨及胫骨全骨髓,利用全骨髓培养法培养于含体积分数为10%FBS的DMEM-F12培养液中。以碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)为指标,96孔板梯度筛选作用最佳浓度。增殖分析采用MTT法。以1×10-6 mol.L-1的最佳浓度作用并成骨性诱导(1×10-7mmol.L-1地塞米松、10 mmol.L-1β-甘油磷酸钠和50 mg.L-1抗坏血酸)培养的d 4、8、12、16测ALP活性、钙盐沉积量,d 16进行ALP和钙化结节组织化学染色及计数。成骨性诱导后不同时间点提取Total RNA,RT Real-Time PCR法检测bFGF、IGF-1、Osterix、Runx-2、BMP-2及COL-Ⅰ的基因表达情况。结果 8-异戊烯基柑橘素不能促进BMSCs增殖,但8-异戊烯基柑橘素在1×10-6 mol.L-1时能促进其向成骨性分化,表现为提高BMSCs的ALP活性、促进钙盐沉积、增加钙化结节数量、提高bFGF、IGF-1、Osterix、Runx-2、BMP-2及COL-Ⅰ的mRNA表达水平。结论 8-异戊烯基柑橘素可诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,作为促进骨修复和抗骨质疏松的有效成分具有较大的药用价值。

8-异戊烯基柚皮素的全合成方法研究

以2,4,6-三羟基苯乙酮和对羟基苯甲醛为原料,经过异戊烯基化、羟基保护、羟醛缩合、环化、去保护基等5步反应,以19.6%的总收率成功合成了8-异戊烯基柚皮素(8-Prenylnaringenin)。优化了关键中间体(5)的合成条件,收率达到47%。结构经1 H NMR、13C NMR和MS(ESI)表征。

8-异戊烯基黄酮类天然产物的微波促进Claisen重排合成

8-异戊烯基黄酮是一类具有显著生物活性的天然产物.以2,4,6-三羟基苯乙酮和3,4-二羟基苯甲醛为原料,用氯甲基甲醚保护羟基,经羟醛缩合、碘催化环合、过氧丙酮(DMD0)氧化、O-异戊烯基化、微波促进的Claisen重排、脱甲氧甲基保护基、O-甲基化和异戊烯基侧链环合等反应步骤,完成了8-异戊烯基槲皮素-3-甲醚(1)、8-异戊烯基槲皮素-3,7,3’,4'-四甲醚(2)和ArtochaminC⑶这3种8-异戊烯基黄酮类天然产物的合成.并对由微波促进的由5-O-异戊烯基黄酮类化合物合成8-C-异戊烯基黄酮类化合物的Claisen重排反应的关键步骤进行了探讨.所有合成的化合物经1HNMR、^13CNMR和MS等结构确证.

8-异戊烯基柑橘素抑制骨髓细胞向破骨细胞分化及骨吸收活性

研究8-异戊烯基柑橘素(8-prenylnaringenin,8-PNG)对骨髓细胞向破骨细胞分化及骨吸收活性的影响。从出生24 h内的青紫兰兔四肢骨髓中分离培养破骨细胞,加入8-PNG(1×10 7、1×10 6和1×10 5mol.L 1),以1×10 7mol.L 117β-雌二醇(17β-estradiol,E2)作为阳性对照。培养5天后进行TRAP染色和TRAP活性检测,7天后进行甲苯胺蓝染色和骨吸收陷窝数量与面积的分析。分别于加药后2、4、8、12、24、36及48 h进行AnnexinV染色,观察破骨细胞凋亡情况;于12、24和36 h提取总RNA,用real-time RT-PCR法检测TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)和CTSK(cathepsin K)的基因表达水平。结果显示,8-PNG(1×10 6和1×10 5mol.L 1)组的TRAP染色阳性细胞即破骨细胞数量明显低于空白对照组(P<0.01),但只有8-PNG(1×10 5mol.L 1)组显著低于E2组(P<0.05);TRAP活性的变化呈相同趋势;骨陷窝数和面积的计量结果亦呈相似变化趋势;E2组使破骨细胞的凋亡高峰大大提前,且凋亡数量最多,其次为8-PNG(1×10 5mol.L 1)组,8-PNG(1×10 7mol.L 1)组与空白对照组比较无差异。8-PNG(1×10 7、1×10 6和1×10 5mol.L 1)可显著抑制TRAP和CTSK的基因表达,且呈剂量依赖性。结果表明,8-PNG能抑制骨髓细胞向破骨细胞分化,并能抑制破骨细胞的骨吸收活性,其机制与诱导破骨细胞凋亡和抑制骨吸收关键酶的基因表达与活性有关。

RP-HPLC法检测酒花中的黄腐酚、异黄腐酚与8-异戊烯基柚皮素

为实现酒花中3种有效组分——黄腐酚、异黄腐酚和8-异戊烯基柚皮素的同步检测,利用反相高效液相色谱建立这3种物质的同步检测体系。采用ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,4μm),乙腈-1%甲酸溶液作流动相,非线性梯度洗脱,流速0.8 mL/min,柱温30℃,紫外检测波长370 nm和288 nm。试验结果表明,在优化的色谱条件下,3种物质的标准曲线线性关系良好,相关系数均大于0.998,精密度好(RSD<1%),回收率在93%～106%之间。该检测方法可以同步测定酒花中的黄腐酚、异黄腐酚和8-异戊烯基柚皮素。此外,考察了不同溶剂的提取效果,结果发现用中等极性溶剂提取这3种物质的效果较好。

8-异戊烯基柑橘素与柑桔素对体外培养破骨细胞活性影响的比较研究

目的:研究8-异戊烯基柑橘素(8-prenylnaringenin,PNG)和柑桔素(naringenin,NG)影响体外培养破骨细胞活性和凋亡的差异,探讨8-异戊烯基团的生理活性。方法:从青紫兰乳兔四肢长骨中分离出破骨细胞,培养于含10%FBS的α-MEM培养液中,分别加入浓度为1×10-5mol.L-1的PNG和NG。药物干预4 d后进行TRAP染色和TRAP酶活性测定,7 d后进行甲苯胺蓝染色。于加药后48 h内多个时间点进行Annexin V-FITC染色,观察破骨细胞凋亡情况,并提取总RNA,用Real-time RT-PCR法检测TRAP及Cathepsin K(CTSK)的基因表达情况。结果:与对照组相比,PNG和NG组的TRAP阳性细胞即破骨细胞数均显著减少,TRAP酶活性显著降低,形成骨吸收陷窝的数量和面积明显减少,TRAP和CTSK的基因表达水平明显降低。PNG组与NG组相比,以上所有指标均是前者显著低于后者。此外,PNG组的破骨细胞凋亡高峰于加药后12 h到达,而NG组是24 h后到达,且前者的凋亡总数显著高于后者。结论:PNG抑制破骨细胞骨吸收和诱导破骨细胞凋亡的活性明显高于NG。由于两者分子结构的唯一差别在于8-异戊烯基团,因此,8-异戊烯基团可提高黄酮母核的抗骨吸收活性。

调控爪哇正青霉生物合成8-异戊烯基柚皮素的关键酶鉴定及性质研究

采用对硝基苯酚法建立爪哇正青霉生物转化合成8-异戊烯基柚皮素体系中O-脱甲基酶酶活的分光光度测定方法;研究生物催化合成8-异戊烯基柚皮素的过程;采用3种经典的细胞色素P450酶抑制剂对P450酶和生物转化反应之间的关系进行鉴定;研究O-脱甲基酶的酶学性质。研究结果表明,生物转化体系中O-脱甲基酶酶活力在第4天达到最大值,其最适反应温度60℃,最适p H 8.0。

8-异戊烯基柑橘素和柑橘素对体外培养大鼠股骨组织代谢活性的影响

目的:比较研究8-异戊烯基柑橘素和柑橘素对体外培养大鼠股骨组织代谢活性的影响。方法:体外分离培养大鼠股骨组织,然后随机分为4组,其中3组分别给予雌二醇(终浓度为1×10-8mol·L-1)、8-异戊烯基柑橘素(终浓度为1×10-5mol·L-1)和柑橘素(终浓度为1×10-5mol·L-1),另外1组加生理盐水作为对照。分别在培养的第3、6、9、12、15和18 d测定大鼠股骨组织中碱性磷酸酶活性和钙含量,并采用RT-PCR检测骨保护素、Ⅰ-型胶原、Runx-2和骨形态发生蛋白基因的mRNA表达水平。结果:8-异戊烯基柑橘素、柑橘素和雌二醇均可提高股骨组织中碱性磷酸酶的活性,增加钙含量,并上调opg、bmp-2、collagen-I和runx-2 mRNA的表达水平;8-异戊烯基柑橘素活性强于柑橘素。结论:8-异戊烯基柑橘素和柑橘素均能改善体外培养大鼠股骨组织的代谢活性。

啤酒花中8-异戊烯基柚皮素提取及含量测定方法的优化及验证

目的优化啤酒花中8-异戊烯基柚皮素(8-prenylnaringenin,8-PN)的提取及含量测定方法,并进行验证。方法采用L_8(4~1×2~2)正交试验,料液比为1∶15,利用回流法提取啤酒花中的8-PN,反相高效液相色谱法测定啤酒花中8-PN的含量[色谱分离条件:ODS C18反相柱(4.6 mm×250 mm,0.45μm),用乙腈、1%甲酸进行梯度洗脱,流速:1.2 ml/min,检测波长:288 nm,柱温:30℃]。探讨提取溶剂(甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯)、提取时间(40、60 min)、提取温度(40、60℃)对啤酒花中8-PN提取含量的影响。结果以正丁醇为提取溶剂,料液比为1∶15,利用回流提取,提取温度40℃,时间40 min,测得啤酒花中8-PN的最高提取含量为79.1 mg/kg。该方法的标准曲线相关系数R^2=0.999 8,线性范围为0.001~0.1 mg/ml,检出限为0.122 mg/L;检测浓度为0.03 mg/ml标准液的保留时间和峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于1%,加标回收率在98%~102%之间。结论优化的方法可简便、准确地测定啤酒花中8-PN含量,为啤酒花中8-PN的进一步分离、纯化提供了实验依据。

8－异戊烯基黄酮类化合物的波谱学特征

综合了从朝鲜淫羊藿（ＥｐｉｍｅｄｉｕｍｋｏｒｅａｎｕｍＮａｋａｉ）的地上部分分离获得的８个８－异戊烯基黄酮类化合物的波谱学特征

UHPLC-Q Exactive高分辨质谱联用法分析淫羊藿中的化学成分

目的采用UHPLC-Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术鉴定分析淫羊藿药材成分。方法采用Thermo Hypersil GLOD C_(18)(100 mm×2.1 mm,1.9μm)色谱柱,体积分数0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为0.3 mL·min^(-1),柱温为40℃,电喷雾正、负离子模式扫描。结果共分析和鉴定出79个化合物,包括黄酮类、生物碱类、有机酸类和木脂素类化合物,其中16个化合物经与对照品比对鉴定。鉴定的黄酮类包括46个异戊烯基黄酮醇类化合物,异戊烯基黄酮醇类负离子模式二级特征碎片为m/z 367、351、513、353和323。初步鉴定化合物41、54、76、65和69为新的异戊烯基黄酮。结论淫羊藿中异戊烯基黄酮醇类多具有淫羊藿素或8-异戊烯基山奈酚苷元母核结构,该结果为淫羊藿成分的系统分析提供了数据支持。

基于多指标定量指纹图谱和化学计量学的淫羊藿质量标准提高研究

进一步完善淫羊藿质量评价体系,提高淫羊藿质量标准。以6种8-异戊烯基黄酮苷作为指标成分,通过HPLC对4个品种、共24批次淫羊藿开展多指标定量指纹图谱的研究,并结合聚类分析(Hierarchical Clustering Analysis,HCA)、主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)化学计量学方法进行质量评价。4个品种淫羊藿在相似度、指标成分含量上差异较大。发现朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ和宝藿苷Ⅰ是造成不同品种淫羊藿差异的特征性成分,淫羊藿次苷Ⅰ和宝藿苷Ⅰ可作为药材质量控制指标成分。建立的多指标定量指纹图谱分析方法稳定、可靠,结合化学计量学可更加全面、快速对淫羊藿进行质量评价,为今后提高淫羊藿的质量标准提供了科学依据。

RP-HPLC测定川明参药材中香豆素含量

目的建立测定川明参药材中2种香豆素成分欧前胡素及5-异戊烯基-8-甲氧基补骨脂素含量的RP-HPLC测定方法。方法色谱柱:Kromasil-C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-水(65∶35),流速为1ml/min,柱温为30℃,检测波长为246nm.结果欧前胡素在0.16～0.97μg(r=0.9998),5-异戊烯基-8-甲氧基补骨脂素在0.13～0.76μg(r=0.9996)范围内与色谱峰面积线性关系良好,欧前胡素和5-异戊烯基-8-甲氧基补骨脂素的平均回收率分别为98.79%、98.11%,RSD分别为1.65%、1.73%.结论该测定方法准确、简便、重复性好。研究结果为建立完善川明参药材质量标准奠定了基础。

基于Wnt/β-catenin和AMPK信号通路探讨小槐花黄酮抑制结肠癌细胞增殖和转移作用

目的 研究小槐花Desmodium caudatum抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用,并探讨其对Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路的调控作用。方法 采用不同条件制备8种小槐花提取物,MTT法检测小槐花提取物1~8对HCT-116、SW480细胞增殖的影响;结晶紫染色检测小槐花提取物2、3对结肠癌HCT-116、SW480细胞集落形成的影响;划痕实验检测小槐花提取物2、3对HCT-116、SW480细胞迁移的影响;从活性较高的提取物2中提取分离出5个黄酮类化合物(1~5),MTT法检测化合物1~5对HCT-116、SW480、HepG2、RAW264.7、LX-2细胞增殖的影响;结晶紫染色检测化合物1(8-异戊烯基槲皮素,0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μmol·L^(-1))对HCT-116和SW480细胞集落形成的影响,划痕实验检测8-异戊烯基槲皮素对HCT-116和SW480细胞转移的影响。Western blotting实验检测8-异戊烯基槲皮素对HCT-116和SW480细胞中AMPK和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响;荧光素酶报告基因检测实验观察8-异戊烯基槲皮素对β-catenin与T细胞因子(TCF)结合能力的影响。结果 与对照组比较,小槐花根茎提取物2和3以及8-异戊烯基槲皮素能显著抑制结肠癌细胞的增殖和迁移(P<0.05、0.01、0.001)。与对照组比较,8-异戊烯基槲皮素能够显著上调p-AMPK蛋白的表达(P<0.05、0.001),显著下调AMPK、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A (CPT-1A)和脂肪酸合成酶(FAS)蛋白的表达(P<0.05、 0.01、 0.001),表明其能够促进癌细胞AMPK信号通路的激活。与对照组比较,8-异戊烯基槲皮素显著下调β-catenin以及其下游糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、核内原癌基因(c-Myc)和G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1)的蛋白表达(P<0.05、0.01、0.001),同时显著降低TCF报告基因结合位点(野生型)和荧光素酶开放阅读框TOPflash(pGL3-OT)活性(P<0.05、0.01),但不影响FOPflash(含突变位点)活性,表明其抑制β-catenin的表达和β-catenin/TCF复合物的结合。结论 小槐花黄酮8-异戊烯基槲皮素通过调控Wnt/β-catenin和AMPK信号通路抑制结肠癌细胞增殖和转移。

异戊烯基转移酶N端截短强化异戊烯基柚皮素合成

8-戊烯基柚皮素(8-prenylnaringenin,8-PN)是一种强有效的雌激素,具有很高的药用价值,同样也是多种异戊烯基黄酮的前体。微生物合成8-PN主要面临异戊烯基转移酶(prenyltransferases,PTs)催化活性较低以及前体供给不足等问题,严重阻碍了8-PN在微生物体内的高效合成。文中以苦参(Sophora flavescens)来源的SfN8DT-1为对象,研究如何实现更高效的柚皮素异戊烯基化反应。结构预测显示,SfN8DT-1主要由9个α-螺旋和8个环的主体,以及一个近120个氨基酸的长侧链组成。将侧链不同位点序列截断的SfN8DT-1在酿酒酵母中表达,发现截短至K62位点时8-PN产量最高,将该蛋白命名为SfND8T-1-t62。SfN8DT-1-t62与柚皮素和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)进行分子对接,发现K185是一个潜在的关键位点。对底物0.5 nm范围内的氨基酸进行丙氨酸扫描突变,突变体K185A对底物的亲和力下降,表明K185是一个潜在的关键催化位点。模拟饱和突变表明,突变体K185W对配体的亲和力增强,而K185饱和突变后8-PN产量显著下降,说明K185对SfN8DT-1的功能至关重要。另外,结合甲羟戊酸(mevalonate,MVA)途径关键基因的强化,8-PN产量达到31.31 mg/L,说明DMAPP的供给也是8-PN合成的关键因素。最后,将产量最高的菌株在5 L发酵罐中进行发酵,发酵120 h后8-PN产量达到44.92 mg/L,是目前报道的最高水平。

中药苦参主要黄酮类成分的研究

中药苦参为豆科槐属植物苦参Sophora flavescenes Ait.的干燥根,具有清热燥湿、杀虫利尿的功能,主治热痢便血、阴肿阴痒、湿疹、皮肤搔痒,外用治疗滴虫性阴道炎等。黄酮是苦参中一类重要的活性成分,为建立苦参黄酮质量控制方法提供对照品,研究苦参黄酮抗滴虫和抗菌等作用机制和构效关系,首先对其主要黄酮类成分进行了研究,从中分离鉴定了6个主要化合物,分别为5-甲氧基-7,2′,4′-三羟基-8-异戊烯基二氢黄酮(1)、异黄腐醇(2)、3β,7,4′-三羟基-5-甲氧基-8-异戊烯基二氢黄酮(3)、降苦参酮(4)、苦参酮(5)和苦参醇I(6)。化合物1为新化合物,化合物3为首次从本植物得到,并首次报道了化合物3和5的13C NMR数据。

LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中4种淫羊藿黄酮苷

建立大鼠血浆中朝藿定A、B、C及淫羊藿苷的LC-MS/MS法,并应用于大鼠肌肉注射喘可治注射液后血浆中4种黄酮苷浓度的测定及喘可治注射液的药物动力学研究。采用的色谱条件为Agilent Eclipse XDB-C_(18)(150 mm×2.1 mm,5.0μm)色谱柱,乙腈-0.1%甲酸水溶液(35∶65)为流动相,流速0.22 mL·min^(-1),柱温40℃;质谱条件为电喷雾多反应离子监测(MRM)负离子检测模式,血浆样品采用固相萃取法处理。结果显示,朝藿定A、B、C及淫羊藿苷在1~1 000 ng·m L^(-1)浓度内具有良好的线性关系;日内精密度RSD<5.99%,日间精密度RSD<10.16%;各成分相对回收率介于88.1%~101.1%,RSD<7.9%,绝对回收率介于72.0%~86.6%,RSD<6.3%。研究表明,该分析方法专属、灵敏、快速,适用于血浆中淫羊藿黄酮苷浓度的测定。