8-氯腺苷诱导的组蛋白H3K79双甲基化促进NBS1和p21的基因转录激活

组蛋白H3第79位赖氨酸甲基化(H3K79me)修饰有单甲基、双甲基及三甲基3种形式,是常染色质的标志.然而,对于组蛋白H3K79三种甲基化各自在基因转录、DNA损伤修复中所起的作用尚不十分清楚.本研究以8-氯腺苷(8-Cl-Ado)为DNA双链断裂(DNAdouble-stranded breaks,DSB)诱导剂,采用Western印迹,在人肺癌细胞H1299检测出了DNA修复分子NBS1、细胞周期检验点相关分子p21,并发现H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3三种甲基化修饰的组蛋白明显增加;染色质免疫共沉淀结合实时定量PCR实验显示,只有H3K79me2与DNA损伤检验点分子p21、DNA修复分子NBS1的启动子区域相结合,说明H3K79双甲基化修饰与这些基因的转录激活有关.结果提示,在8-氯腺苷引起DSB时,是H3K79me2、而不是H3K79me1和H3K79me3参与NBS1和p21基因转录激活时的染色质重塑.8-氯腺苷诱导H3K79双甲基化增强、促进H3K79me2所在染色质区域的NBS1和p21基因转录激活可能是8-Cl-Ado抑制肿瘤细胞生长作用机制之一.

八氯腺苷诱导SH-SY5Y和SK-N-SH细胞G_2/M期阻滞的分子机制不同

为探索八氯腺苷的抗肿瘤作用机制,以神经母细胞瘤SH-SY5Y和SK-N-SH细胞为对象,采用四唑盐比色实验（MTT法）证明,八氯腺苷具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用,这种抑制作用呈剂量-时间依赖性.流式细胞分析显示,10 μmol/L八氯腺苷作用48 h后可导致靶细胞生长停滞于G2/M期;SH-SY5Y细胞发生明显细胞凋亡,但SK-N-SH细胞却未见凋亡.Hoechst 33342染色显示,SK-N-SH细胞发生了核分裂异常.蛋白质免疫印迹分析证明,10μmol/L八氯腺苷处理SH-SY5Y 48～72 h后,G2检验点调节蛋白ATM、Chk1、Cdc25C和Cdc2磷酸化形式明显上调,同时伴有caspase-3的激活,提示SH-SY5Y细胞发生了G3检验点通路和细胞凋亡途径的激活.与SH-SY5Y细胞不同,在SK-N-SH细胞中,八氯腺苷处理24～96 h时,磷酸化ATM、磷酸化Chk1/Chk2、磷酸化Cdc25C以及磷酸化Cdc2的水平呈现逐渐降低的趋势.结果提示,SK-N-SH细胞在八氯腺苷处理后发生了G2检验点失败.蛋白质免疫印迹分析还显示,八氯腺苷可诱导p53在SH-SY5Y细胞的表达,但却不能影响SK-N-SH细胞的p53组成性表达水平.p21在SK-N-SH的组成性表达随八氯腺苷处理时间延长而逐渐减少,但在处理前后的SH-SY5Y细胞均未检测到p21蛋白的表达.上述实验结果提示,八氯腺苷抑制两种细胞增殖的机制不同：在SH-SY5Y细胞,八氯腺苷可激活ATM-Chk-Cdc25C-Cdc2/cyclin途径和凋亡通路,使细胞发生G2/M期阻滞和细胞凋亡;在SK-N-SH细胞,八氯腺苷诱导G2检验点失败,导致细胞阻滞在有丝分裂期,并发生有丝分裂异常.2种不同的细胞命运可能还与p53和p21表达不同有关.

8-氯腺苷通过ADAR1调控miR-335-5p抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

该文探讨了8-氯腺苷(8-chloro-adenosine, 8-Cl-Ado)调控RNA编辑酶1(adenosine deaminases acting on RNA1, ADAR1)对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,确定了ADAR1与miR-335-5p表达的相关性。10μmol/L的8-Cl-Ado作用于乳腺癌细胞后(不同时间点),采用CCK-8检测细胞的增殖情况;Transwell检测细胞的迁移和侵袭情况;Western blot检测ADAR1蛋白的表达水平;CCK-8检测ADAR1过表达对8-Cl-Ado抑制乳腺癌细胞增殖的影响;Transwell检测ADAR1过表达对8-Cl-Ado抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响;miRNA芯片筛选8-Cl-Ado处理后乳腺癌细胞中上调的miRNA, qRT-PCR验证其与ADAR1的相关性。结果显示, 8-Cl-Ado能抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭;ADAR1蛋白的表达量随8-Cl-Ado处理时间的增加而逐渐降低;ADAR1的过表达能减弱8-Cl-Ado对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用;miR-335-5p经8-Cl-Ado处理后表达水平上调,与ADAR1呈负向调控关系。以上结果表明, 8-Cl-Ado下调ADAR1抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与ADAR1下调mi R-335-5p有关。