氮缺乏对84K杨树组培苗光合特性及次生代谢的影响

研究氮缺乏对84K杨树组培苗生长的影响,以期为84K杨的育种与繁殖提供理论基础。以84K杨树组培苗为实验材料,通过氮缺乏处理,测定84K杨树组培苗的生物量、光合参数、叶绿素荧光参数,并进一步分析氮缺乏时全氮、全碳、碳氮比、总酚及抗氧化活性的变化。结果显示:随着培养基中氮含量的减少,84K杨树组培苗的干重、净光合速率(P n)和气孔导度(G s)均受到抑制,同时,氮缺乏导致84K杨树组培苗叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量及最大光化学效率(Fv/Fm)降低。此外,随着培养基中氮素的减少,84K杨树组培苗中全氮含量显著减少,碳氮比显著升高,总酚含量显著增加。抗氧化分析结果表明,培养基中氮含量越低,组培苗的抗氧化活性越好。相关性分析表明,生物量与光合参数及叶绿素含量之间存在极显著正相关,但与总酚含量之间存在负相关;全氮含量与总酚含量之间存在负相关,与全碳及碳氮比之间存在正相关;同时84K杨树组培苗总酚含量及抗氧化活性之间具有明显的相关性。研究结果表明:氮缺乏可对84K杨树组培苗的光合生理及次生代谢产物产生影响,不利于84K杨树组培苗的生长和光合作用,但促进了多酚等抗氧化物质的产生。本研究可为84K杨树的栽培管理提供理论依据和基础数据。

光信号对AmRosea1过表达84K杨花青素合成及基因表达的影响

为了探究光信号引起AmRosea1过表达84K杨(Populus alba×P.glandulosa‘84K’)植株颜色变化的原因,以野生型和AmRosea1过表达84K杨为试验材料,开展LED光、自然光、LED红光、LED蓝光和LED红蓝光处理,测定不同光强和光质下野生型和转基因株系的生理指标变化情况。结果显示:在不同光强下,与LED光处理相比,自然光处理下转基因株系叶片变红,花青素和可溶性糖含量升高,叶绿素含量和POD活性降低。不同光质处理30 d后,与LED红光和蓝光相比,在LED红蓝光诱导下,转基因株系叶片变红,且花青素含量升高,可溶性糖含量和POD活性下降,叶绿素含量略有降低。根据试验结果推测,强光和红蓝光质能激活AmRosea1过表达84K杨的花青素生物合成通路,使转基因株系积累大量的花青素,从而使植株叶片变红。

胡杨PeERF1基因提高转基因银腺杨84K耐旱性研究

[目的]分析PeERF1基因在胡杨干旱胁迫下的作用和PeERF1转基因植株抗旱的生理适应机制,为进一步研究该基因在木本植物中的抗旱调控机制奠定基础。[方法]以胡杨为材料进行20%PEG6000模拟干旱(0、12和24 h)处理,对胡杨PeERF1基因进行时空表达模式分析。以非转基因(WT)、过表达35S::PeERF1转基因植株(PE)、显性抑制35S::PeERF1-SRDX转基因植株(SE)为试验材料,采用不同浓度PEG6000(对照组,20%)处理WT、PE和SE模拟干旱胁迫,并对其进行表达模式、生长性状和生理指标分析。[结果]研究结果表明PeERF1基因在胡杨叶中的表达水平最高,其次是茎和根。在正常状态下,转基因植株和WT生长性状、叶绿素含量、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和过氧化物酶(POD)含量变化不大。在20%PEG6000处理后,PE转基因植株比WT表现出更好的生长状态,PE转基因植株的叶绿素含量、CAT和POD含量高于WT,PE转基因植株MDA含量低于WT。而SE转基因植株则表现出相反的性状。[结论]本研究结果初步显示干旱胁迫下,PeERF1基因转基因植株生长状态、叶绿素含量、过氧化氢酶、丙二醛和过氧化物酶等相关生理指标均发现显著变化。PeERF1对转基因杨树响应干旱起到了正向调控的作用。

84K杨树耐盐基因转化研究

在已建立了 84K杨叶片外植体再生系统的基础上 ,利用叶盘法首次开展了 84K杨双价耐盐基因 mtl D/gut D的转化研究 ,经诱导不定芽及诱导生根阶段卡那霉素 (选择性抗生素 )连续筛选 ,获得了 1 6株卡那霉素抗性转化植株。抗性植株经 PCR检测 ,有 4株呈阳性。耐盐实验表明 ,3株阳性植株抗 Na Cl能力比对照有不同程度提高。

84K杨叶片外植体再生系统的建立

利用正交试验等设计 ,首次系统开展了 84K杨叶片外植体再生系统建立研究 ,确定了84K杨叶片外植体最适不定芽诱导培养基及激素配比为 MS+ 6- BA1 .5 mg/L+ NAA0 .1mg/L,不定芽最适生根诱导培养基及激素配比为 GMS+ NAA0 .0 1 mg/L+ IBA0 .2 5 mg/L。该实验结果为

84K杨再生和遗传转化体系的优化

为了优化84 K杨的再生和遗传转化体系,以84 K杨树叶片为外植体,采用正交试验研究了不同培养基和激素配比对芽和芽苗生根的影响,并从预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间及添加AS(乙酰丁香酮)5个方面,以卡那霉素抗性苗频率为衡量指标,研究了各因素对84 K杨遗传转化率的影响。结果表明,84 K杨叶片最适的芽诱导培养基及激素配比为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L,芽苗最适诱导生根培养基及激素配比为1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.05 mg/L;优化筛选的最适转化体系为:农杆菌活化菌液用MS液体培养基稀释10倍,浸染5 min,共培养4 d。采用上述优化的再生和遗传转化体系,84 K杨每片叶平均生芽数可达20个,芽苗生根率可达99%,生根数为6条,叶盘转化率可达35%。

84K杨的生长特性及杂交可配性

经过多年育苗、造林试验及相关研究,得出了84K杨的生长特性主要表现为:生长迅速,1年生苗通直高大,平均高3.5m左右,最高达5.0m;苗木速生期出现在6、7月份,苗高、地径生长量分别占全年总量的64.5%和46.4%。对比试验林中材积生长量比毛白杨高79.8%,比毛白杨3个优良无性系大11.3%;抗病性强,3年生对比林中84K杨对主要病害黑斑病、叶枯病和锈病的感病指数分别为1.60%、1.18%和0.28%;对干部溃疡病,生长旺盛的植株几乎不感染;抗寒、抗旱性强,84K杨的抗寒、抗旱性比新疆杨、M101杨、毛白杨30号都强;根系发达,根蘖能力强,育苗成活率高;84K杨作亲本的杂交组合杂交可配性好,杂种优势强,是很好的杂交亲本。

84K杨叶片再生系统的建立

选用84K杨的叶片作为外植体,MS作为基本培养基,采用不同浓度组合的BA和NAA对84K杨再生系统进行了研究.结果表明,在MS培养基中单独添加2.0mg／L BA时,不定芽分化率为90％,单独添加0.3mg/L NAA时,不定根产生率最高(90％),但无不定芽生成.采用1.5mg/LBA+0.3mg/LNAA组合搭配时,不定芽分化率最高(95％).在此基础上,采用M1(MS+1.5mg/L BA+0.3mg/L NAA)培养基,研究了不同着生位置的叶片、同一着生位置叶片的不同切段以及叶片在培养基上的放置方式对84K杨叶片再生的影响,结果表明带有叶柄的下切段比其余叶片切段不定芽再生率高,幼嫩叶片比老化叶片再生率高,叶片近轴端向下接触培养基比远轴端向下接触培养基再生率高.叶片再生系统的建立为开展84K杨的工厂化育苗和遗传转化奠定了基础.

OsNHX1基因转化84K杨的研究

采用农杆菌介导的方法开展了水稻Na+ /H+ 逆向转运蛋白基因OsNHX1转化84K杨的研究.建立了84K杨的叶外植体高频再生系统,经诱导不定芽及诱导生根阶段卡那霉素连续筛选,获得了大量卡那霉素抗性转化植株.PCR检测和Southern杂交检测表明,OsNHX1基因已成功整合到84K杨基因组.耐盐实验表明,转基因植株能在2 0 0mmolNaCl条件下正常生长.

84K杨基因转化受体系统的建立

以84K杨为研究对象,通过建立叶片再生系统及卡那霉素敏感性试验,确立了稳定高效的基因转化受体系统。结果表明,以MS培养基为基本培养基,0.5～1.0mg/L6-BA+0.01～0.1mg/LNAA组合时,叶片出芽率不到50%,每叶平均生芽数5～6个;1.0～1.5mg/L6-BA+0.02mg/L2,4-D组合时,叶片出芽率达90%～100%,每叶平均生芽数约20个。用后者附加不同质量浓度梯度卡那霉素,确定叶片外植体芽诱导卡那霉素临界筛选质量浓度为20mg/L。利用对84K杨芽生根效果较好的培养基GMS+0.01mg/LNAA+0.25mg/LIBA,附加不同质量浓度梯度卡那霉素,筛选出芽生根卡那霉素临界质量浓度亦为20mg/L。

激素水平对84K杨组培快繁的影响

本实验以84K杨腋芽和叶片为外植体,研究不同激素水平对84K杨组织培养的影响,探讨84K杨快速繁殖试管苗的有效途径。研究结果表明:84K杨腋芽增殖的最佳培养基为MS+6 BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L;叶片不定芽诱导初期的最佳培养基为MS+6 B1.0mg/L+NAA0.5mg/L,MS+KT1.0mg/L+NAA0.1mg/L为不定芽壮苗的最佳培养基;从生根和移栽成活率上看不添加任何激素的1/2MS基本培养基和1/2MS+NAA0.2mg/L+IBA0.5mg/L为84K杨最佳生根培养基。

超量表达FBL1对84K杨根系和生长量影响研究

生长素及其信号转导系统对植物的生长发育具有重要的影响。本研究从银腺杨‘84K’(Populus alba×P.glandulosa cl.‘84K’)中分离了生长素受体基因Ptr FBL1,利用PMDC32构建了PMDC32-Ptr FBL1超量表达载体,并通过遗传转化获得了超量表达植株17个。对温室定植的3个转基因株系和对照植株的根系、生长量和光合指标等性状分析结果显示:转基因株系总根长和总根面积达到显著或极显著差异,而根系干质量、平均不定根系长度、平均不定根直径差异不显著;株高、平均节间长、地径和高径比皆高于对照,且大多数转基因株系达到显著差异;除气孔限制值(Ls)低于对照外,气孔导度(Cd)、水分利用效率(WUE)、光能利用效率(LUE)和叶绿素相对含量皆高于对照,且大多数转基因株系达到显著或极显著差异。以上结果表明,可能是FBL1超表达增加了转基因株系根系面积,提高了水分和养分的吸收利用,进而导致转基因株系光能吸收和转化效率提高,引起转基因株系生长加快。

银白杨与84K杨、毛白杨杂交及苗期测定

采用室内切枝水培杂交方法进行银白杨与84K杨、毛白杨杂交试验。结果表明:银白杨与84K杨杂交的可配性高于银白杨与毛白杨杂交组合。银白杨与毛白杨杂交苗的苗高、地径生长量均稍高于银白杨与84K杨的杂交苗。银白杨×84K杨杂交苗的抗病、虫能力都高于银白杨×毛白杨。隶属函数值综合评价结果表明,银白杨×84K杨杂交苗的选择优势较高,选择出优良无性系的机率较大。

84K杨愈伤组织再生体系和直接分化再生体系遗传转化的比较性研究

植物转基因必须以建立良好的植物转化受体系统为基础,而良好的受体系统必须以具有高频率的转化率及较强的再生能力为前提。实验以84K杨叶片为材料研究其在不同培养条件、不同种类及浓度的植物激素对其脱分化及再分化的影响,并建立了两种成熟的组织再生系统,得出组织培养体系与遗传转化体系的受体系统在激素配比方面存在一定差距,所以在此基础上进行了PCK1、PCK2两个基因的愈伤途径和不定芽途径途径的遗传转化,并对两种遗传转化体系进行了对比性分析并总结出两种体系的优缺点。

干旱和高盐胁迫下钙离子依赖核酸酶基因CDD对银腺杨84K生长发育的影响

【目的】钙离子依赖型脱氧核糖核酸酶(CDD)具有消化单链和双链DNA的活性,但CDD对水分等胁迫的响应尚未明确。本研究以CDD转基因银腺杨84K为材料,分析在干旱和高盐胁迫条件下CDD在84K杨生长中的作用,探讨CDD对干旱和高盐胁迫的响应,可为揭示杨树CDD基因在抗逆中的作用提供参考。【方法】以过表达PtoCDD和敲除PagCDD转基因银腺杨84K组培苗为材料,对其进行模拟干旱和高盐处理,分析其受干旱、高盐非生物胁迫条件下的表型变化,包括植株高、不定根数目。通过切片观察,分析不同处理条件下茎段木质部大小变化。利用qRT-PCR分析在不同处理条件下CDD转基因植株中水通道蛋白基因(PIP)的表达。【结果】与84K对照相比,在正常条件下CDD转基因植株株高没有显著差异,而干旱、高盐条件下CDD缺失突变体植株显著高于对照和CDD过表达植株,而过表达植株极显著低于对照及突变体。说明CDD过表达增强了杨树对干旱、高盐的敏感性,而敲除CDD后降低了杨树对干旱、高盐的敏感性。组织切片分析显示,在正常条件下木质部细胞层数呈现CDD过表达>对照84K>CDD缺失突变体,而在干旱、高盐条件下木质部细胞层数为CDD过表达<对照84K <CDD缺失突变体。表明CDD参与了木质部细胞分化过程,并当受到干旱、高盐胁迫时,CDD的表达对木质部分化过程的影响尤为明显。不定根数目统计显示,在正常条件和高盐条件下植株不定根数目呈现为CDD缺失突变体>对照84K>CDD过表达,且差异均达到显著水平或极显著水平,而干旱条件下差异不显著。表明CDD差异表达引起的不定根数目上的变化在一定程度上反映了杨树对干旱和高盐胁迫的敏感性。qRT-PCR分析显示,CDD过表达和CDD缺失突变体植株中均表现出多个PIP基因诱导高表达。表明CDD的表达变化可引起PIP基因不同成员的诱导表达,从而改变杨树的水分利用。【结论】杨树CDD的缺失或过量表达引起不定根数目的变化,同时改变了杨树的水分利用,影响对干旱和高盐胁迫的敏感性,导致胁迫下生长的变化。上述结果表明CDD参与杨树响应干旱和高盐胁迫过程。

杨品种‘84K’光合生理的不同过程对干旱和复水的响应

以杨品种‘84K’(Populus alba×P. glandulosa)为材料,对其干旱胁迫及复水后光合生理特性的变化进行了研究。结果显示,在干旱胁迫及复水过程中,杨品种‘84K’光合作用相关的主要反应对此过程响应不同步。在干旱胁迫过程中,‘84K’的羧化反应速度、气孔导度(Gs)、叶肉导度(Gm)均显著下降,但前者下降幅度小于后两者,此时的光合作用主要受Gs和Gm制约。复水之后,Gm很快得到恢复,而光化学淬灭过程、羧化反应速度均没有恢复到对照水平,此时是光化学淬灭和(或)羧化反应制约了‘84K’的碳固定及光合作用。

银腺杨84K盐胁迫应答基因PagMYBR96的克隆及表达分析

【目的】基于转录组测序分析,在银腺杨84K中鉴定到1个应答盐胁迫的MYB-related基因PagMYBR96,克隆了该基因并对其特征及参与的生物学过程进行分析,为后续基因功能及调控机制研究和林木基因工程育种提供参考。【方法】采用PCR技术从84K杨cDNA中扩增PagMYBR96基因,对其编码的蛋白序列进行理化性质分析。利用生物信息学分析,对该蛋白的保守结构域、进化关系、亲疏水性、跨膜区域、信号肽、磷酸化位点、二级结构进行分析。采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时转化试验分析蛋白亚细胞定位情况;通过酵母转化筛选试验分析蛋白的转录激活活性;通过RT-qPCR分析基因的空表达模式;借助基因共表达及功能注释与富集分析解析基因集参与到的生物学过程和代谢通路。【结果】从银腺杨84K中克隆了长度为882 bp的PagMYBR96基因,编码293个氨基酸,分子质量为33 306.33 Da,理论等电点为6.32,含有保守的MYB结构域和特征氨基酸,与长梗柳中的同源蛋白亲缘关系较近,没有跨膜区域,也不存在信号肽,可能是一个亲水性蛋白质。PagMYBR96为核定位蛋白,且在酵母中没有转录激活活性。基因时空表达模式分析结果表明,PagMYBR96在84K杨的根和叶中均可应答盐胁迫,且在胁迫初期上调表达,到达峰值后渐渐恢复。PagMYBR96及与其共表达的518个基因与细胞过程、代谢过程、生物调节、对刺激应答、发育过程等相关,且分别被显著富集到类泛素蛋白结合酶活性、类泛素蛋白转移酶活性、泛素蛋白转移酶活性和泛素结合酶活性等GO term及氨酰-tRNA生物合成、泛素介导的蛋白水解和丙酮酸代谢等通路中。【结论】银腺杨84K PagMYBR96基因可以在不同的组织中应答盐胁迫,并通过不同的生物学过程参与植物的生长发育及胁迫应答。PagMYBR96及其共表达基因的功能与泛素蛋白酶体系统介导的蛋白质降解及丙酮酸代谢等过程相关。