结核杆菌抗原85B抑制自噬促进霍奇金淋巴瘤细胞凋亡机制研究

目的探讨结核杆菌抗原85B(mycobacterial antigen 85B,Ag85B)抑制自噬促进霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)细胞凋亡及机制。方法回顾性收集新疆医科大学第一附属医院收治的80例HL及同期30例淋巴结反应性增生患儿(对照组)临床资料及病理组织切片。采用免疫组化分析微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、自噬降解底物蛋白1(sequestosome 1,P62/SQSTM1)、Beclin-1在HL及对照组患儿病理组织中的表达。将人霍奇金淋巴瘤细胞(HDLM-2)分为HDLM-2组、HDLM-2+结核杆菌抗原85B(mycobacterial antigen 85B,Ag85B)组(Ag85B分别为0.5、1、2、4μg/mL)。采用CCK8法检测HDLM-2细胞增殖;实时荧光定量聚合酶链式反应法检测LC3、P62、Beclin-1、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)mRNA的表达;凋亡试剂盒检测细胞凋亡。结果HL组LC3、Beclin-1阳性表达高于对照组(P<0.05),P62阳性表达低于对照组(P<0.05);Ⅲ~Ⅳ期较Ⅰ~Ⅱ期LC3、Beclin-1阳性表达增高,P62阳性表达降低(P<0.05)。细胞实验结果显示,HDLM-2+Ag85B组与HDLM-2组比较,细胞增殖受抑,LC3和Beclin1的mRNA表达减低,P62、PI3K、Akt和mTOR的mRNA表达增高,细胞凋亡增加,且在Ag85B为2μg/mL时,Ag85B干预HDLM-2细胞24 h作用最强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论自噬在HL患儿中增强,且随疾病的分期增加而增强;Ag85B可抑制HL肿瘤细胞增殖及自噬,促进细胞凋亡,其机制可能与促进PI3K/Akt/mTOR通路相关。

牛分枝杆菌Ag85B的生物信息学分析及多表位候选抗原的构建

为了构建基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,试验采用生物信息学方法对Ag85B蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构等进行分析,预测其T、B淋巴细胞抗原表位,并构建以pET-28a(+)为载体的多表位候选抗原,分析预测多表位候选抗原的理化性质、抗原性并进行免疫模拟。结果表明:Ag85B蛋白有325个氨基酸残基,相对分子量为34.58085,理论等电点为5.62,脂肪系数为72.18,亚细胞定位于线粒体、细胞质和高尔基体中,具有亲水性、信号肽和跨膜结构域,属于分泌型蛋白,其无规则卷曲和β-转角结构的占比分别28.15%和8.62%,含有3个T淋巴细胞优势表位和8个B淋巴细胞优势表位。构建的Ag85B多表位候选抗原为亲水性蛋白和非致敏原,两次预测免疫原性参数分别为0.893和1.524,可诱导特异性的体液和细胞免疫应答。说明试验成功构建出基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,且该多表位候选抗原可能诱导机体产生T、B淋巴细胞免疫应答。

结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫

目的 研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法 以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RNA的表达 .将 p TB30 m质粒肌注免疫 BAL B/c和 C5 7BL /6小鼠 ,EL ISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,生物学方法检测 IFNγ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果 RT- PCR检测证实 p TB30 m可在 CHO细胞中表达 .p TB30 m免疫小鼠可引起较高水平的 Ag85 B特异性的抗体应答 .免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞增殖显著 ,BAL B/c和 C5 7BL/6小鼠 IFNγ的量分别达到 136 0 ng· L- 1 和 196 5 ng· L- 1 ,而生理盐水和空质粒对照组均低于 80 ng· L- 1 .结论 应进一步研究 p TB30 m作为TB的基因疫苗用于 TB的防治的效果 .

结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建

目的构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体 pUC19中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3的相应酶切位点。结果结核分枝杆菌H37Ra株Ag85B成熟蛋白的编码基因经序列测定证实 ,与Erdman株完全一致 ;用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实 ,克隆基因正确插入载体pcDNA3。结论以Ag85B成熟蛋白的编码基因为基础的真核表达载体的构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究

目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力

目的 :研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力 .方法 :采用皮下包埋的方法 ,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠 3次 ,每次间隔 2wk,用MTB培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins,CFP)作为抗原 ,ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度 .为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答 ,最后一次免疫完成后 4wk ,取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞 ,体外用抗原刺激 ,MTT法检测淋巴细胞刺激反应 ,ELISA检测悬液中IFN γ水平 .另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv ,4wk后计数脾脏细菌负荷数 .结果 :Ag85B ESAT6蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶10 0 0 ,ESAT6 Ag85B蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶5 0 0 0 .融合蛋白Ag85B ESAT6和ESAT6 Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为 2 .4 0± 0 .17和 2 .6 0± 0 .2 5 ,而生理盐水组只有 0 .90± 0 .2 1;相对应的IFN γ含量分别为 (3.5 1± 0 .30 ) μg/L和 (4 .0 5± 0 .4 1) μg/L ,显著高与生理盐水对照组 (0 .5 0± 0 .2 5 ) μg/L ,P <0 .0 5 ,但不及BCG免疫组 (5 .5 5±0 .31) μg/L .与生理盐水免疫组 (细菌负荷6 .31± 0 .13)相比较 ,融合蛋白免疫的BALB/c小鼠 。

T-bet佐剂对Ag85B抗结核DNA疫苗的免疫调节

目的:构建以Th1转录因子T-bet为基因佐剂的Ag85B新型DNA疫苗,并研究其免疫调控作用。方法:RT-PCR法扩增出Ag85B基因和T-bet基因,克隆入pcDNA3.1质粒构建T-bet和Ag85B真核表达质粒,脂质体法转染重组质粒至RAW264.7细胞系,Western blot法检测质粒蛋白表达情况。3次肌肉注射免疫BALB/c小鼠,末次免疫2周后,ELISA法检测血清中抗Ag85B抗体滴度。同时将脾脏淋巴细胞悬液于Ag85B刺激下培养,ELISA法检测培养液中细胞因子分泌情况。结果:质粒蛋白成功表达,并且质粒剂量与质粒蛋白表达水平呈正相关。此外,T-bet/Ag85B不仅诱导IgG2a滴度显著增高伴随IgG1显著降低,而且还刺激IL-2/IFN-γ(Th1类)分泌增加伴随IL-4/IL-10(Th2类)减少。结论:T-bet增强抗Ag85B特异性IgG2a抗体反应,并诱导显著的Th1细胞优势免疫。

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达质粒 pCDAg85B A ,酶切、DNA测序鉴定 ,用脂质体法将 pCDAg85B A转染COS 7细胞 ,采用RT PCR ,ELISA方法检测其表达 .结果 :Ag85B Ag85A融合基因定向克隆入pcDNA3.1 (+) ,双向测序表明碱基无突变 ,Ag85B Ag85A融合基因在真核细胞中能表达 .结论 :成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 。

Ag85A和Ag85B DNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果

目的:探讨Ag85A和Ag85BDNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果。方法:致癌剂N-甲基亚硝基脲(methyl nitrosourea,MNU)膀胱灌注雌性Wistar大鼠制备膀胱癌模型。将建模成功的48只大鼠随机分为生理盐水组、空白质粒组、卡介苗组、Ag85A DNA疫苗组、Ag85B DNA疫苗组、Ag85A+Ag85B DNA疫苗组(每组各8只),建模后第7、14、21天于大鼠右后肢肌内注射相应药物。第28天处死大鼠,流式细胞仪检测各组大鼠脾脏细胞的CD4+和CD8+T细胞亚群数量并计算CD4+/CD8+比值;ELISA法检测大鼠血清中IFN-γ分泌水平;剥离膀胱肿瘤进行组织病理学检查。结果:成功建立大鼠膀胱癌模型,致瘤率100%。经疫苗治疗后,Ag85A组、Ag85B组和Ag85A+Ag85B组膀胱肿瘤体积均有所减小、病理分级也有所减轻,但效果不及卡介苗组。Ag85A组、Ag85B组、Ag85A+Ag85B组和卡介苗组CD4+T细胞亚群数量分别为(17.27±2.95)%、(23.15±1.56)%、(30.80±1.83)%、(38.05±1.48)%;CD8+ T细胞亚群数量分别为(9.03±1.06)%、(10.28±0.39)、(11.29±0.74)、(13.14±1.24);CD4+/CD8+比值分别为(1.90±0.10)、(2.25±0.08)、(2.73±0.19)、(2.97±0.23);血清IFN-γ含量分别为(96.94±12.38)、(131.03±26.68)、(179.20±28.88)、(240.53±32.17)pg/ml;与生理盐水、空白质粒组相比,Ag85A组、Ag85B组、Ag85A+Ag85B组能够显著提高以上4项检测指标(P<0.01),但均低于卡介苗组;Ag85A+Ag85B组效果强于Ag85B组、更强于Ag85A组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:应用Ag85A和Ag85BDNA疫苗均可提高膀胱癌大鼠的免疫功能,其效果为Ag85A+Ag85B>Ag85B>Ag85A,但总体上都达不到卡介苗的抗癌免疫效果。

结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的目的基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定。通过镍柱对融合蛋白进行纯化。在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达。融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础。

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。

Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究

扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性

目的 研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法 用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论 Ag85

分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗的构建和表达

目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PCR分别扩增出结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B的全编码序列及ESAT-6基因,然后将两基因融合插入pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6分泌性表达质粒。用电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗。重组卡介苗经热诱导后,SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白85B-ESAT-6的表达及其免疫学活性。结果通过PCR、酶切以及测序鉴定,pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒构建完全正确,SDS-PAGE电泳未能直接观察到表达的融合蛋白条带,用ESAT-6蛋白的多抗血清通过Westernblotting证实了该蛋白主要分泌性表达于胞外并具有免疫学活性。结论分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗构建成功。

结核分枝杆菌H37Rv两种抗原Ag85b、HspX的制备及其与佐剂的联合应用

目的用分子生物学方法制备H37Rv的两种抗原Ag85b、HspX,通过与铝佐剂和CpG佐剂联用免疫小鼠进行初步药理学实验以观察其生物学活性。方法常规方法分别构建重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,内切酶鉴定目的片段后两种质粒分别转化BL-21大肠杆菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后分别产生两种蛋白;用阴离子交换柱Source30、QHP以及疏水层析柱对两种蛋白进行纯化;蛋白测序进行鉴定。纯化后的两种蛋白分别与铝佐剂和CpG佐剂联用(Ag85b,Ag85b+Al,Ag85b+CpG,Ag85b+Al+CpG;HspX,HspX+Al,HspX+CpG,HspX+Al+CpG),免疫C57/BL小鼠,同时设置生理盐水对照组,取脾细胞进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测干扰素-γ(IFN-γ)的分泌;同时进行淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞经体外刺激后的增殖情况。结果成功构建了两种重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,成功诱导表达了两种蛋白;经过纯化,两种蛋白纯度均达到95%;经鉴定两种蛋白纯化产物的N端15个氨基酸序列与目的序列相同;Ag85b+CpG、Ag85b+Al和Ag85b+CpG+Al组经Ag85b(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05);HspX+CpG+Al组经HspX(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05)。结论成功表达并纯化了结核分枝杆菌H37Rv的两种抗原Ag85b和HspX,与铝佐剂和CpG佐剂联用后成功刺激小鼠产生了细胞免疫反应,证实了两种重组蛋白的生物学活性,为下一步药效学评估奠定了基础。

TAT-Ag85B蛋白疫苗的制备和抗结核分枝杆菌效果评价

目的探讨利用HIV反向转导结构域(TAT-PTD)系统表达的转导性Ag85B蛋白疫苗的抗结核分枝杆菌效应。方法构建p ET28a-Ag85B、p ET28a-TAT-Ag85B质粒,原核表达纯化和鉴定后获得Ag85B、TAT-Ag85B蛋白;将BALB/c小鼠随机分为3组:Ag85B组,TAT-Ag85B组,PBS组。重组蛋白经皮下免疫小鼠3次,末次免疫后1周处死部分小鼠,ELISA检测小鼠血清中Ag85B抗体滴度,以及脾细胞分泌的γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)的水平;用流式细胞术检测巨噬细胞经Ag85B、TAT-Ag85B蛋白刺激后表面分子CD80、CD86变化情况;剩余小鼠经尾静脉感染H37Rv结核分枝杆菌,感染后第1、2、4、8周动态监测小鼠肺和脾内结核分枝杆菌载量,并在感染后8周取肺脏进行HE染色,观察肺组织病变情况。结果成功获得Ag85B、TAT-Ag85B蛋白;与Ag85B相比,TAT-Ag85B诱导小鼠表达高水平的Ig G和IFN-γ、IL-2,感染小鼠的脾、肺结核分枝杆菌载量明显减少,肺组织病变范围小、结核分枝杆菌数量少。另外,TAT-Ag85B增强巨噬细胞表面分子CD80/CD86的表达。结论 TAT-Ag85B蛋白疫苗增强巨噬细胞的抗原提呈能力,诱导小鼠产生强烈的Th1免疫应答,有一定的抗结核分枝杆菌保护作用。

结核分枝杆菌Ag85B与IL-12基因真核共表达质粒的构建及表达

目的 :构建结核分枝杆菌Ag85B和鼠IL 12基因的共表达载体pBud85B IL12。方法 :将结核分枝杆菌Ag85B基因和鼠IL 12基因同时克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4 .1中 ,构建真核共表达质粒pBud85B IL12。以pBud85B IL12转染COS 7细胞 ,通过RT PCR及ELISA方法检测目的基因的表达。结果 :在COS 7细胞中同时可检测到Ag85B和IL12的表达。结论 :pBud85B IL12共表达质粒的成功构建 ,为对其免疫原性。

结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较

目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 .

结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达 ,获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法 应用PCR技术扩增结核分支杆菌H3 7RvAg85BDNA序列 ;以质粒pET2 4b为表达载体 ,构建Ag85B重组质粒 ,然后转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;以IPTG诱导转化子 ,通过SDS -PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平 ,采用Novagen公司生产的His .Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果 重组质粒pET2 4b -Ag85B测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL2 1(DE3 )细胞内以包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 3 0 %左右。纯化后的rAg85B样品经SDS -PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为 95 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 10mg左右纯化的重组蛋白。结论 pET2 4b -Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白 。

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 .方法 :采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT6 4编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3经PCR扩增融合 ,定向克隆入 pcDNA3.1(+)中 .采用脂质体转染法将pcDNA/Ag85B MPT6 4 (pcDNA/AM )转染COS 7细胞 ,用RT PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达 .结果 :Ag85B MPT6 4融合基因经双向DNA序列测定 ,碱基突变率为 0 .11%(2 /170 7) ,突变为无意义突变 ;重组质粒转染COS 7细胞后经检测证实 ,该融合基因能在真核细胞中表达 .结论 :成功地构建了Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 。