太平洋牡蛎MyD88-3基因克隆及溶藻弧菌感染后的表达模式

【目的】克隆太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)新型髓样分化因子88(MyD88)基因MyD88-3,分析其在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后的表达模式,为探究太平洋牡蛎MyD88基因在免疫调控中的作用和太平洋牡蛎健康养殖提供理论依据。【方法】克隆CgMyD88-3基因编码区(CDS),运用ProtScale、SWISS-MODEL和InterPro等进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR分析溶藻弧菌感染前后,CgMyD88-3基因在太平洋牡蛎不同组织中的表达情况。【结果】CgMyD88-3基因CDS长度为537 bp,共编码178个氨基酸残基,CgMyD88-3蛋白相对分子量为20.74 kD,理论等电点为6.10。亚细胞定位预测结果显示CgMyD88-3蛋白位于细胞质,含5个酪蛋白激酶II磷酸化位点(17TEED20、29SNLE32、76TQNE79、118TAND121、123TKED126)和3个蛋白激酶C磷酸化位点(26TMK28、148TAK150、169SEK171)。CgMyD88-3氨基酸序列只含1个TIR(Toll/interleukin-1 receptor)结构域,不含Death结构域。CgMyD88-3氨基酸序列与美洲牡蛎(Crassostrea virginica)CvMyD88-like氨基酸序列相似性最高,为100%,基于MyD88氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,CgMyD88-3先和美洲牡蛎CvMyD88-like聚为一支,然后与太平洋牡蛎CgMyD88-T1和CgMyD88-T2聚为一支。实时荧光定量PCR检测发现,CgMyD88-3基因在健康太平洋牡蛎6种组织中均有表达,相对表达量最高的为外套膜组织,鳃组织次之,在其他组织中依次为血细胞>性腺>消化腺>闭壳肌。溶藻弧菌感染后,太平洋牡蛎闭壳肌、消化腺、血细胞和鳃组织中的CgMyD88-3基因相对表达量均明显升高,在闭壳肌、消化腺和血细胞中感染72 h后达最高,在鳃中感染6 h后达最高,而在外套膜组织中感染后各时间段的CgMyD88-3基因相对表达量均低于0 h。【结论】CgMyD88-3基因在健康的太平洋牡蛎各组织中均有分布,在外套膜中的相对表达量最高。溶藻弧菌刺激可诱导CgMyD88-3基因高表达,表明CgMyD88-3基因可能在太平洋牡蛎抵御外界微生物及病原体感染中扮演重要角色。

当归芍药散基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对阿尔茨海默病模型大鼠神经炎症的影响研究

目的研究当归芍药散对β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)诱导的阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease,AD)模型大鼠神经炎症及Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子(MyD88)/核因子-κB(NF-κB)信号通路的调控作用。方法SD大鼠大脑双侧侧脑室注射Aβ1-42构建AD动物模型。实验分为假手术组、模型组、当归芍药散组和阳性药物组。假手术组、模型组给予生理盐水灌胃,当归芍药散组给予当归芍药散24 g·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,阳性药物组给予米诺环素36 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,连续灌胃14 d。Morris水迷宫实验测定大鼠的学习记忆能力。复制模型成功后取材,HE染色检测海马神经元组织病理形态学变化,免疫荧光法检测小胶质细胞和星形胶质细胞活化情况,实时荧光定量PCR(qPCR)检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达情况,免疫印迹法(Western Blot)检测TLR4、MyD88和p-NF-κB p65蛋白的表达水平,免疫组化法检测NF-κB p65核转位的情况。结果与假手术组比较,AD大鼠学习记忆能力明显下降(P<0.01),海马组织神经元形态受损,小胶质细胞和星形胶质细胞活化增加(P<0.01),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平升高(P<0.01),TLR4、MyD88蛋白表达水平明显上升,p-NF-κB p65与NF-κB p65的比值明显增高(P<0.01),NF-κB p65在胞核的表达明显增加(P<0.01)。与模型组比较,当归芍药散组和阳性对照组AD大鼠学习记忆能力明显提高(P<0.01,P<0.05),大鼠海马组织神经元形态功能明显恢复,小胶质细胞和星形胶质细胞活化减少(P<0.01),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平明显降低(P<0.01),TLR4、MyD88蛋白表达水平明显降低(P<0.01),p-NF-κB p65与NF-κB p65的比值明显降低(P<0.01),NF-κB p65在胞核的表达明显减少(P<0.01)。结论当归芍药散可能通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制神经炎症反应,发挥神经保护作用。

泼尼松联合阿奇霉素序贯疗法治疗儿童重症肺炎支原体肺炎的疗效及对血清TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白和下游炎性因子水平的影响

目的探讨泼尼松联合阿奇霉素序贯疗法治疗儿童重症肺炎支原体肺炎的疗效及对血清Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/核因子κB(NF-κB)信号通路相关蛋白和下游炎性因子水平的影响。方法招募2019年1月至2022年6月唐山市妇幼保健院收治的儿童重症肺炎支原体肺炎患者120例,采用随机数字表法将其分为对照组(采用阿奇霉素治疗,60例)和观察组(采用泼尼松联合阿奇霉素治疗,60例)。治疗4周后,比较两组治疗效果、临床肺部感染量表(CIPS)评分、TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白以及下游炎性因子的水平。结果观察组患者的体温恢复时间、咳嗽缓解时间、咳痰缓解时间、喘息缓解时间、肺部啰音消失时间较对照组更快,住院时间更短,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组的体温、白细胞计数、气道分泌物、氧合情况、胸部X射线、痰培养等CIPS项目评分以及总分均较治疗前降低,且观察组评分较对照组更低,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组TLR4、MyD88、NF-κB、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、降钙素原(PCT)水平均降低,且观察组水平较对照组更低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论泼尼松联合阿奇霉素序贯疗法对人体血清TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白及下游炎性因子水平有显著下调作用,可提高儿童重症肺炎支原体肺炎患者的临床疗效。

和厚朴酚对铜绿假单胞菌肺炎小鼠炎症因子及TLR4/MyD88/NF-κB通路的影响

【目的】观察和厚朴酚对铜绿假单胞菌肺炎小鼠的治疗作用及机制。【方法】将50只小鼠随机分为正常组,模型组,和厚朴酚低、中、高剂量组(剂量分别为96、192、384 mg·kg-1·d-1),每组10只。除正常组,其余各组小鼠通过气管滴注铜绿假单胞菌液建立肺炎模型。连续给药4周后,计算小鼠肺指数,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测血清白细胞介素6(IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,苏木素-伊红(HE)染色法观察肺组织病理损伤情况,实时定量聚合酶链反应(qRTPCR)法和Western Blot法分别检测肺组织Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子-κB(NF-κB)mRNA和蛋白相对表达量。【结果】正常组小鼠肺组织未见明显异常改变;模型组小鼠肺组织可见严重的炎症细胞浸润、水肿、间质充血和肺泡壁增厚;和厚朴酚低、中、高剂量组小鼠肺组织病理损伤得到不同程度的减轻。与正常组比较,模型组小鼠肺指数,血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平以及肺组织TLR4、MyD88和NF-κB mRNA和蛋白相对表达量升高(P<0.05);与模型组比较,和厚朴酚低、中、高剂量组小鼠肺指数,血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平以及肺组织TLR4、MyD88和NF-κB mRNA和蛋白相对表达量降低(P<0.05),表现为和厚朴酚高剂量组<和厚朴酚中剂量组<和厚朴酚低剂量组。【结论】和厚朴酚可减轻铜绿假单胞菌肺炎小鼠肺组织损伤,降低炎症反应,其可能是通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥作用。

脊髓损伤小鼠通过激活小胶质细胞MyD88通路促进神经元铁死亡

目的:探索脊髓损伤(SCI)后小胶质细胞(MG)炎性活化对神经元铁死亡的作用及其关键信号通路,为修复脊髓损伤寻找新的治疗靶点。方法:小鼠胸段脊髓夹伤后3 d,通过免疫荧光检测钙接头蛋白(Iba-1)与4-羟基壬烯醛(4HNE)的表达。以脂多糖(LPS)及髓系分化初级反应蛋白88(MyD88)抑制剂ST2825处理小鼠原代小胶质细胞,另以糖氧剥夺(OGD)处理SH-SY5Y细胞,再将两种细胞用Transwell共培养24 h,CCK-8法检测SH-SY5Y细胞活力,碘化丙啶(PI)染色结合流式细胞仪分析SH-SY5Y细胞死亡情况,用Western Blot和细胞免疫荧光染色检测小胶质细胞的炎性活化情况和SH-SY5Y细胞铁死亡分子表达情况。结果:小鼠脊髓夹伤后3 d可见损伤局部神经元铁死亡与激活的小胶质细胞密切相关。与对照组相比,LPS刺激上调小胶质细胞中MyD88、核因子-κB(NF-κB)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和白细胞介素1β(IL-1β)等分子表达。激活的小胶质细胞与SH-SY5Y细胞共培养,可促进OGD诱导的SH-SY5Y细胞死亡率进一步增加,同时使胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(xCT)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、血红素加氧酶1(HO-1)、铁蛋白重链(FTH1)等分子的表达进一步降低。而MyD88抑制剂ST2825能抑制小胶质细胞的促炎性激活,明显减轻SH-SY5Y细胞铁死亡发生。结论:SCI局部神经元铁死亡与激活的小胶质细胞密切相关,小胶质细胞促炎性激活可促进神经元的铁死亡。

刺血疗法结合壮医药线点灸对急性痛风性关节炎大鼠TLRs/MyD88信号通路的影响

背景随着环境及人们饮食结构的改变,急性痛风性关节炎(AGA)已成为临床常见疾病,AGA易反复发作对患者健康造成危害,临床工作中刺血疗法结合壮医药线点灸对AGA有确切的疗效,但其作用机制尚未明确。目的基于Toll样受体(TLRs)/髓样分化因子88(MyD88)信号通路探讨刺血疗法结合壮医药线点灸治疗AGA的作用机制。方法实验时间为2021年5月—2022年3月,将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、刺血组、药线组、秋水仙碱组、刺血结合药线组,每组10只。除空白组外,其余各组均将尿酸钠悬浮液注入大鼠右踝关节腔内制备AGA模型,于造模24 h后秋水仙碱组予秋水仙碱悬浮液灌胃治疗,刺血疗法组予阿是穴点刺放血治疗,药线组予壮医药线围灸病灶处,刺血结合药线组先予阿是穴点刺放血再行围灸法。观察造模后6、12、24、72 h右踝关节肿胀程度;苏木素-伊红染色观察右踝关节滑膜组织病理改变;采用酶联免疫吸附试验检测大鼠血清中白介素(IL)-10、IL-8及环氧化酶2(COX-2)水平;蛋白质印迹法检测右踝关节滑膜组织中MyD88和IKK-β蛋白表达。结果模型组、刺血组、药线组、秋水仙碱组造模后6、12、24、48、72 h右踝关节外踝横截面直径均高于空白组,刺血结合药线组造模后6、12、24、48 h右踝关节外踝横截面直径高于空白组,刺血组、药线组、秋水仙碱组、刺血结合药线组造模后48、72 h右踝关节外踝横截面直径低于模型组(P<0.05)。刺血组、药线组、秋水仙碱组及刺血结合药线组右踝关节其炎性细胞的浸润情况较模型组有所改善。模型组、刺血组、药线组、秋水仙碱组以及刺血结合药线组大鼠IL-8、COX-2水平高于空白组,IL-10水平低于空白组,秋水仙碱组、刺血结合药线组、刺血组、药线组IL-8、COX-2水平低于模型组,IL-10水平高于模型组,刺血组、药线组大鼠IL-8、COX-2水平高于秋水仙碱组,IL-10水平低于秋水仙碱组,刺血组、药线组大鼠IL-8、COX-2水平高于刺血结合药线组,IL-10水平低于刺血结合药线组(P<0.05)。模型组、药线组、刺血组、刺血结合药线组MyD88、IKK-β水平高于空白组,秋水仙碱组MyD8水平高于空白组,药线组、秋水仙碱组MyD88、IKK-β水平低于模型组,刺血组、刺血结合药线组MyD88水平低于模型组(P<0.05)。结论刺血疗法结合壮医药线点灸能通过调节TLRs/MyD88信号通路来改善AGA关节炎性症状,起到治疗作用,刺血疗法结合壮医药线点灸可能是AGA的潜在替代疗法。

斜带石斑鱼MyD88基因的克隆与表达

本研究运用RACE-PCR技术获得斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)基因,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析。研究结果表明1795bp的cDNA全长序列,包括ORF 870 bp、5'UTR 243 bp和3'UTR 682 bp,3'UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和两个mRNA不稳定基序(ATTTA)。SMART软件预测该蛋白N端和C端分别存在死亡结构域和TIR结构域(Toll/IL-1 receptor homology domain,TIR);与其它脊椎动物MyD88的序列同一性达57.1%～78.7%;用NJ法构建的系统进化树中,斜带石斑鱼MyD88和其它已报导的鱼类MyD88聚为一枝。qPCR检测结果显示MyD88基因mRNA主要表达于肝脏、脾脏、头肾和胸腺等组织。本研究为进一步探讨MyD88在斜带石斑鱼TLR信号传导中的作用奠定基础。

赤眼鳟MyD88基因cDNA克隆与表达特性研究

实验使用RACE-PCR技术获得了赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)的c DNA全长,命名为Sc My D88。ScMy D88的cDNA全长为1779 bp,其中开放阅读框855 bp,共编码284个氨基酸残基,推导的蛋白质分子量为33.053 k D,理论等电点为5.66。赤眼鳟My D88具有典型的MyD88结构特征,包括死亡结构域和TIR结构域(Toll-IL-1 receptor domain,TIR),其氨基酸序列和鲤科鱼类具有高度保守性,相似性达到了90%以上,特别是和武昌鱼相比,相似性达到了98%。在检测的9个赤眼鳟组织和器官中均有MyD88表达,其中肝脏、头肾和体肾中表达水平最高,在脑中表达量最低。在草鱼呼肠弧病毒(Grass carp reovirus,GCRV)感染初期(12h内),My D88在赤眼鳟免疫组织中表达水平急剧上升,特别是在脾脏和体肾中尤为明显,随后恢复正常水平。研究表明,MyD88在赤眼鳟抵抗GCRV入侵的免疫应答反应初期发挥了重要作用。

厚壳贻贝MyD88-4基因的生物学特性及其对沙氏弧菌的免疫应答

为理解髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)基因的生物学特性以及对细菌胁迫的响应,本研究克隆了厚壳贻贝MyD88基因(命名为McMyD88-4)cDNA全长序列,其全长3 930 bp,开放阅读框2 607 bp,编码868个氨基酸。其中,13~109位的氨基酸序列为死亡结构域(death domain,DD),347~481位的氨基酸序列为TIR(toll/interleukin-1 receptor)结构域,TIR结构域包含3个高度保守的区域Box1、Box2和Box3;McMyD88-4蛋白的空间结构包含6个α螺旋(α-helix)和4个β折叠(β-sheet)。同源性分析显示,McMyD88-4蛋白序列与长牡蛎MyD88最相似,其一致性和相似性分别为60%和77%;其次,与虾夷扇贝、海湾扇贝和菲律宾蛤仔相似度较高,其一致性和相似性分别为40%~51%和58%~67%。系统进化树结果显示,McMyD88-4先与长牡蛎和扇贝聚为一支,然后与黑腹果蝇聚为一支,脊椎动物单独聚为一支。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现,McMyD88-4基因在厚壳贻贝各组织和器官中均有表达,其中在外套膜和鳃中的表达量最高,而血细胞中表达量最低。厚壳贻贝经沙氏弧菌感染后,McMyD88-4基因表达量在免疫相关组织中急剧上升,分别在感染后3和6 h达到峰值,且在消化腺中的上调水平显著高于鳃和外套膜。研究表明,McMyD88-4在厚壳贻贝抵御外界病原体侵染过程中,尤其是弧菌感染方面发挥重要作用。

齐口裂腹鱼MyD88基因的cDNA序列及特征分析

利用RT-PCR和RACE-PCR技术获得了齐口裂腹鱼（ Schizothorax prenanti） TLR信号转导途径中的关键接头分子MyD88基因cDNA全长序列，该序列共1479 bp，包括编码284个氨基酸残基的855 bp的开放阅读框，177 bp 5′非翻译区和447 bp 3′非翻译区，编码284个氨基酸。利用SMART软件分析，结果显示，该蛋白在N端和C端分别存在死亡结构域（Death domain， DD）和TIR结构域（Toll/IL-1 receptor homology domain， TIR）。齐口裂腹鱼MyD88氨基酸序列与鲤（ Cyprinus carpio）、斑马鱼（ Danio rerio）、大黄鱼（ Larimichthys crocea）、花鲈（ Lateolabrax japonicas）、虹鳟（ Oncorhynchus mykiss）的相似性为69.37％～91.90％，其中与斑马鱼的相似性最高。用 NJ 法构建的系统进化树中，齐口裂腹鱼MyD88和其它鱼类MyD88聚为一枝。

欧洲鳗鲡MyD88基因的克隆及其免疫功能分析

髓样分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）是TLR（toll-like receptor）信号通路的关键接头蛋白，在先天性免疫中发挥重要作用。实验首次克隆了欧洲鳗鲡MyD88基因cDNA全长序列，命名为AaMyD88，其全长为1539bp，开放阅读框为846bp，编码282个氨基酸。该蛋白三维丝带空间结构图与人类的MyD88十分相似，具有MyD88家族典型的死亡结构域和TIR（toll-1ike／IL-1receptor）结构域，其中TIR结构域中含有3个序列高度保守的boxl、box2和box3。同源性分析显示，欧洲鳗鲡MyD88氨基酸序列与斑点叉尾鲴相似性最高，为76．3％，与其他鱼类相似性为67．5％～73．2％，与哺乳动物相似性较低，为61．6％～62．6％。欧洲鳗鲡MyD88在系统进化树中与其他鱼类MyD88聚为一支，哺乳类以及两栖类MyD88分别聚为一支。实时荧光定量PCR检测发现，AaMyD88基因在欧洲鳗鲡各组织器官中均有表达，其中在肝脏中的表达量最高，心脏、肠、脾脏以及肾脏中也有较高的表达，而肌肉和鳃中的表达水平较低；欧洲鳗鲡经山羊IgG肌肉注射后，肾脏AaMyD88基因在第7天表达量有显著性提高，14d后恢复至正常水平，而脾脏AaMyD88基因表达水平从第7～21天持续显著上调，于第7天达到峰值，其表达量为肾脏的1．7倍；欧洲鳗鲡鳍细胞系经polyI：C处理后，AaMyD88基因表达水平在3h显著降低，6-48h均有显著升高，于12h达到峰值。LPS处理后的欧洲鳗鲡鳍细胞系AaMyD88基因表达水平在3h显著降低，6和12h显著升高，于12h达到峰值，24h后恢复至正常水平。polyI：C处理组MyD88基因表达水平在12～48h均显著高于LPS处理组。研究表明，MyD88在欧洲鳗鲡抵御外源微生物的免疫应答反应中发挥重要作用。

中华鳖MyD88部分序列克隆及其在组织中的表达差异分析

MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)是多数TLRs(Toll like receptor,TLRs)信号转导过程中的关键接头分子。研究根据MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)TIR结构域(Toll-like/IL-1 receptor domain)保守区设计简并引物,通过PCR扩增,成功地从中华鳖脾脏cDNA中扩增出351bp的目标序列。测序后经结构域和序列比较分析,扩增片段为中华鳖的MyD88 TIR结构域。该序列与大黄鱼、鸡等脊椎动物的MyD88的TIR结构域序列同源性和相似性分别为72.9%～86%和77.6%～83.6%。以热灭活嗜水气单胞菌刺激中华鳖后,经荧光定量PCR检测,在48h内,肝、脾和肾组织中MyD88 mRNA相对表达量均出现不同程度的增加,尤以脾脏中的增幅最为明显,为对照组的6.89倍;中华鳖心脏成纤维样细胞经20ng LPS刺激后1～8h,MyD88表达量有所提高,24h的表达量最高。该研究结果将为开展中华鳖天然免疫奠定良好基础。

臭牡丹大黄素对臭氧应激小鼠模型TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的调节作用

目的观察臭牡丹大黄素对臭氧应激小鼠模型TLR4/MyD88/NF-kB信号通路的调节作用。方法 8周龄清洁级昆明小鼠,随机平均分为7组,每组8只。正常对照组、模型组、大黄素组、大黄素低剂量治疗组、大黄素中剂量治疗组、大黄素高剂量治疗组、激素治疗组。以臭氧应激的方法建立气道炎症小鼠模型。末次刺激24 h后,检测小鼠气道阻力,分类计数外周血及肺泡灌洗液(BALF)中白细胞数目,苏木精-伊红(HE)染色观察气道炎性细胞浸润,RT-PCR及Western Blot检测肺组织中Toll样受体4(TLR4),髓样分化因子(My D88)及核因子κB(NF-κB)的表达水平。结果模型组气道阻力明显增加,气道可见大量炎性细胞浸润。与模型组相比,大黄素治疗组气道阻力明显下降,外周血白细胞(WBC)减少,气道病理改变减轻,肺组织TLR4,MyD88及NF-κB表达明显下降。结论臭牡丹大黄可能通过调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥其抗炎的作用。

七鳃鳗myd88基因的生物学特性及其下游分子的表达模式分析

髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MYD88)是Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路的关键接头分子,在先天性免疫和适应性免疫中都起到重要作用。为了揭示七鳃鳗Myd88的生物学功能,研究首次从七鳃鳗(Lampetra japonica)中克隆了myd88基因,其ORF为852 bp,共编码283个氨基酸,推测的分子量为32.432 k D,等电点为6.25,无信号肽。多重序列比对表明七鳃鳗Myd88的氨基酸序列与其他物种同源性较高,具有高度保守的N端死亡结构域和C端的TIR结构域的Box1、Box2和Box3基序。实时荧光定量PCR分析表明:myd88基因在七鳃鳗各组织中均有低水平转录表达,鳃中表达量最高,其次是肌肉、髓和肾。脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后,七鳃鳗myd88在白细胞中表达量升高最显著,其次是在鳃中的表达量也明显升高,表明七鳃鳗Myd88参与七鳃鳗的抗菌免疫过程。此外,LPS刺激七鳃鳗还能诱导TLR信号通路Myd88依赖途径的下游信号分子Irak1、Traf6、Ikkβ和Nfkb在各组织中的转录表达。研究结果表明七鳃鳗中可能存在TLR/Myd88信号通路,为进一步探究该信号通路参与免疫应答的起源与进化奠定了基础。

小鼠视神经损伤后视网膜中TLR-9与MyD88表达变化

目的:探讨Toll样受体-9(TLR-9)与髓样分化因子(MyD88)在小鼠视神经损伤(ONI)后视网膜中的表达变化。方法:选取8周大小的雄性C57BL/6J小鼠36只,随机分为6组:空白对照组(未做任何处理)、ONI 1d组(视神经损伤后1d取材)、ONI 3d组(视神经损伤后3d取材)、ONI 5d组(视神经损伤后5d取材)、ONI 7d组(视神经损伤后7d取材)、ONI 14d组(视神经损伤后14d取材)。分组后通过视神经夹持的方法制作小鼠视神经损伤模型,利用RT-qPCR与Western-blot检测各组小鼠视网膜中TLR-9与MyD88的mRNA和蛋白水平。结果:ONI 1d组视网膜中TLR-9与MyD88的mRNA和蛋白水平与空白对照组比较无差异(P>0.05);ONI 3d、ONI 5d、ONI 7d、ONI 14d组视网膜中TLR-9与MyD88的mRNA和蛋白水平与空白对照组比较均明显增加(P<0.01)。与空白对照组比较视网膜中TLR-9与MyD88的mRNA和蛋白水平在小鼠ONI 3d开始升高(P<0.01),ONI 5d达到峰值(P<0.001),ONI 7d开始逐渐下降(P<0.01)。结论:小鼠视神经损伤能够激活视网膜中TLR-9与MyD88表达,TLR-9与MyD88可能在视神经损伤的进程中起重要作用。

TLR4-MyD88-NF-kB信号通路与肝炎-肝纤维化-肝癌轴相关性研究进展

Toll样受体4(TLR4)-髓样分化因子88(MyD88)-核转录因子κB(NF-κB)信号通路是疾病理变反应中的关键通路,广泛存在于各组织细胞中,是介导炎性因子在细胞内与细胞之间相互表达的重要信号通路之一。研究发现TLR4-MyD88-NF-κB信号通路在肝免疫异常、炎症反应触发的肝损伤、肝星状细胞的活化及肝纤维化恶化与肝癌的发展中均有重要调节作用。该信号通路在"肝炎-肝纤维化-肝癌轴"(IFC轴)的动态变化与肝癌的转移中可能是一个关键的调节点。本文就TLR4-MyD88-NF-κB信号通路参与IFC轴疾病病理机制的最新研究进展作一综述,为以后相关研究提供参考。

PCV2感染对仔猪肝脏MyD88-NF-κB信号途径的影响

选取31头经检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性的5周龄断奶仔猪,随机分为对照组16头和试验组15头,对照组仔猪每头滴鼻4 mL PBS,试验组仔猪每头滴鼻4 mL 5×105TCID50.mL-1PCV2悬液。于PCV2接种当天剖杀4头仔猪作为对照组,分别于14、21和35 d剖杀4头对照组和5头试验组仔猪,采集肝脏。用激光共聚焦显微镜检测核因子κB/P65(NF-κB/P65)蛋白的核易位变化;蛋白提取法分别提取肝脏细胞核蛋白和胞浆蛋白,Western blot定量检测细胞核中NF-κB/P65和细胞浆中p-IκBα、MyD88蛋白含量的变化;电泳迁移率(EMSA)法检测细胞核中NF-κB DNA的结合率变化。检测结果显示,PCV2接种仔猪,肝脏中NF-κB/P65蛋白核易位逐渐增多,到21 d达到峰值;p-IκBα、MyD88、NF-κB/P65 DNA结合率在接种后均先升高后趋于恢复,并于21 d达到高峰。与对照组仔猪相比,肝脏中MyD88和NF-κB/P65蛋白含量以及NF-κB DNA结合率在14和21 d试验组均显著升高(P<0.05),35 d含量变化不显著;21 d时试验组p-IκBα蛋白含量显著升高。相关性分析显示,NF-κB/P65蛋白含量与MyD88含量、NF-κB DNA结合率之间存在显著正相关,相关系数分别是0.566和0.528。结果表明,PCV2可通过激活MyD88启动NF-κB信号途径;通过IκBα的磷酸化降解激活NF-κB,并促进其进行核易位,使NF-κB与DNA发生结合,调控相关炎性细胞因子的转录和表达。

表没食子儿茶素对TLR4/MyD88/NF-κB通路减轻脂多糖诱导BV2细胞炎症反应的影响

目的研究表没食子儿茶素(EGC)对脂多糖(LPS)诱导BV2小胶质细胞炎症反应的抑制作用及其机制。方法采用LPS诱导BV2细胞炎症反应,噻唑蓝(MTT)法检测LPS对细胞存活力的影响。通过Griess法检测EGC对细胞上清液中一氧化氮(NO)水平的影响。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6的分泌。应用Western blotting法测定BV2细胞中Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子(MyD88)和核因子κB(NF-κB)的表达水平,免疫荧光法检测BV2细胞中NF-κB p65的核转位,以及TLR4和MyD88的表达水平。结果 1μg·mL-1LPS和1~100μmol·L-1EGC对BV2细胞无明显毒性作用。LPS刺激后,BV2细胞中NO释放量显著上升,20μmol·L-1EGC能够显著降低LPS诱导的NO释放。LPS刺激后TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌均显著高于正常对照组,10和20μmol·L-1 EGC能够不同程度抑制炎症因子的分泌。EGC能够显著抑制LPS诱导的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活,抑制NF-κB的核转位。结论 EGC抑制LPS诱导的BV2细胞炎症反应的作用可能与其抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路并介导炎症因子的表达有关。

多索茶碱联合桉柠蒎治疗慢性阻塞性肺疾病急性发作期的疗效及对TLR4-MyD88通路的调控

目的研究多索茶碱联合桉柠蒎治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性发作期的疗效及对Toll样受体4(TLR4)-髓样分化因子88(MyD88)通路的调控作用。方法将确诊的120例急性发作期COPD患者随机均分为观察组和对照组,每组60例。2组患者均采用多索茶碱治疗,观察组患者在此基础上联合桉柠蒎治疗,2组患者均治疗8周。比较2组患者的治疗效果、心肺功能、血气指标、免疫功能、血清TLR4、MyD88水平以及不良反应。结果与对照组比较,观察组患者的治疗效果显著提升;治疗后,2组患者的心肺功能以及血气指标均显著改善,且观察组患者的无氧阈值(AT)显著高于对照组,二氧化碳通气当量斜率(VE/VCO_2)、酸碱度(pH)、二氧化碳分压(PCO_2)和碳酸氢根(HCO^-_3)显著低于对照组,2组患者的血清TLR4和MyD88水平均显著下降,且观察组患者的血清TLR4和MyD88水平均显著低于对照组;2组患者的免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)均显著升高,且观察组患者的IgA、IgM和IgG显著高于对照组。结论多索茶碱联合桉柠蒎在COPD急性发作期患者的治疗中通过对TLR4-MyD88通路的显著下调,改善患者的临床症状,治疗效果显著。

木犀草素对心力衰竭大鼠心肌炎症反应和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

目的观察木犀草素对心力衰竭大鼠心肌炎症反应和Toll样受体4/髓样分化因子88/核转录因子-κB(TLR4/MyD88/NF-κB)信号通路的影响,阐明木犀草素对心力衰竭的可能作用机制。方法将51只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组(S组)、心力衰竭组(H组)和木犀草素治疗组(L组),各17只大鼠。采用开胸手术建立心力衰竭动物模型,L组大鼠给予50 mg/(kg·d)木犀草素(体积3 mL)灌胃。心脏超声测定左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)。苏木精-伊红(HE)染色观察心脏组织形态学变化;Masson染色观察心肌组织胶原形成情况。采用双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清脑钠肽(BNP)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。采用蛋白免疫印迹法测定心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平。结果与S组比较,H组LVEF、FS降低(P<0.05),LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV增加(P<0.05);与H组比较,L组LVEF、FS升高(P<0.05),LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV降低(P<0.05)。HE染色:S组大鼠心肌组织正常;H组大鼠心肌坏死和炎症浸润严重;L组大鼠心肌坏死和炎症浸润明显减轻。Masson染色:与S组比较,H组胶原面积比增加(P<0.05);与H组比较,L组胶原面积比降低(P<0.05)。与S组比较,H组血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平及心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05);与H组比较,L组血清BNP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平及心肌组织IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05)。结论木犀草素可抑制心力衰竭大鼠心肌炎症反应和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,发挥对心力衰竭的保护作用。