草莓9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2228bp,具有完整的开放阅读框(ORF),共1827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。

猕猴桃AcNCED的克隆与表达分析

【目的】9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是类胡萝卜素降解酶,同时是脱落酸(ABA)合成的关键酶。为探明AcNCED基因家族各成员在猕猴桃果实发育期的表达特性。【方法】利用RT-PCR技术从猕猴桃中分离4个NCED基因,分别命名为AcNCED1-4,并用qRT-PCR技术分析它们在猕猴桃不同组织和果实发育期的表达。【结果】AcNCED1、AcNCED2、AcNCED3和AcNCED4的开放阅读框(ORF)分别为1 755、1 830、1 797和1 788 bp,它们分别编码585、610、599和596个氨基酸。经预测,AcNCED1、AcNCED3和AcNCED4蛋白定位于叶绿体,AcNCED2蛋白定位于细胞质,均无信号肽,属于非分泌蛋白。qRT-PCR分析表明,AcNCEDs在茎中表达量最高,根中最低,在果实发育前期及成熟期高表达。【结论】4个基因编码的蛋白都较为保守且表达量均具有组织特异性,为进一步探明AcNCED的生物学功能奠定基础。

ABA对草莓果实成熟和软化的调节

以‘法兰地’草莓为试材,研究草莓果实生长发育过程中内源脱落酸(ABA)含量、FaNCED基因表达量的变化以及外源ABA、去甲二氢愈创木酸(NDGA)和乙烯利处理对果实成熟软化的影响。结果表明:在草莓果实成熟过程中ABA含量和FaNCED表达量出现2次高峰,分别是花后35d(转色期)和花后45d(果实完熟期)。外源ABA促进FaNCED基因的表达及ABA的积累,促进草莓果实的成熟和后熟软化,NDGA处理表现出相反效果,喷施乙烯利表现不明显,推测ABA在草莓果实成熟和后熟软化中可能起着重要作用。

普通小麦及其近缘种NCED基因的克隆及表达分析

利用已知的大麦NCED基因(dbj|BAF02837.1)保守区域设计引物,在野生一粒小麦、硬粒小麦、野生二粒小麦、普通小麦和粗山羊草中分别扩增出长度为782、782、782、7837、83 bp的目的片断,生物信息学分析结果表明,均含有一个开放阅读框,编码242个氨基酸残基组成的蛋白,具有典型的9-顺式-新黄素加双氧酶蛋白的结构域。同源性比对结果表明,普通小麦与大麦的NCED序列具有高度同源性(97%);普通小麦及其近缘种在该区内NCED基因片段的同源性在95%以上。半定量RT-PCR表达分析表明,NCED基因参与了普通小麦及其近缘种对非生物胁迫高渗、高盐的应答反应,但在不同物种或胁迫处理下的表达模式不同,其中粗山羊草和普通小麦在高渗和高盐胁迫下分别表现出了较快的应答反应。

亚洲棉NCED3基因克隆及其抗旱功能分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是脱落酸(ABA)合成过程中的关键限速酶,被证实广泛参与植物的生长发育进程及对非生物胁迫的应答。为了挖掘、鉴定棉花抗旱相关的NCEDs基因,本研究克隆了亚洲棉(Gossypium arboreum)GaNCED3基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了干旱胁迫下该基因的表达特性;并遗传转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),研究了该基因在干旱应答中的功能。结果显示,GaNCED3基因开放阅读框(ORF)全长为1794 bp,其编码的蛋白质包含597个氨基酸。该基因在干旱胁迫处理后上调表达,在处理3 h的根中表达量最高,是对照的27.6倍。在萌发期进行甘露醇模拟的干旱处理,超表达GaNCED3的转基因拟南芥种子萌发率和绿苗率均高于野生型。在幼苗期进行自然干旱处理后,转基因拟南芥植株叶片丙二醛含量显著低于对照(P<0.05),游离脯氨酸积累量显著高于对照(P<0.05)。本研究初步证明了外源超表达GaNCED3基因使植株抗旱能力增强,为进一步研究GaNCED3干旱应答的分子机制提供了理论依据,为抗旱育种提供了候选基因资源。

菊分支NCED酶分子特征及进化分析

为探究9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因家族进化特性,本文利用生物信息学方法,对菊分支类群已完成测序的植物（包括番茄、马铃薯、烟草、甜菜、猴面花）基于全基因组进行NCED基因家族鉴定,并对其蛋白序列特征,保守基序,次级结构以及系统发育关系进行分析。结果表明,NCED酶是由小基因家族编码的酶,其成员为2~4个。蛋白质氨基酸大小在505~652aa之间,分子质量为56.23~71.42 k Da,除Sl NCED6外,其余各蛋白的等电点均表现为酸性,保守基序分析发现各成员均包含10个保守基序,其长度在29~50之间。此外,NCEDs蛋白结构分析显示,一级结构氨基酸序列N端保守性较低,而次级结构均表现为高度保守。系统发育关系发现,来自番茄的Sl NCED5、Sl NCED6与来自马铃薯的St NCED5、St NCED6分别为直系同源蛋白,这与生物学上的亲缘关系一致。

小麦TaNCED1基因植物表达载体的构建

以植物双元表达载体pCAMBIA2300-35为基础,设计带有酶切位点KpnI和XbaI的一对引物,从克隆载体pGEM-NCED1扩增到目的基因TaNCED1,酶切回收后与同样双酶切的表达载体pCAMBIA2300-35连接,获得表达载体pTaNCED1,并将所构建的载体导入根癌农杆菌GV3101菌株,为该基因的功能鉴定及通过基因工程的方法提高小麦的抗逆性奠定了基础。

无核荔枝ABA生物合成关键酶LcNCED基因克隆及其在生理落果阶段中的表达分析

9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoids dioxygenase,NCED)是ABA生物合成途径的关键限速酶,本研究利用RT-PCR技术从A4无核荔枝中分离得到NCED的3条c DNA序列(命名为LcNCED1、LcNCED2和LcNCED3)。通过同源比对和系统进化树分析,LcNCED基因编码的氨基酸序列与拟南芥等30个物种中的NCED氨基酸序列同源性都在65%以上,从而确定LcNCED属于NCED家族;通过与7条拟南芥及5条苹果NCED家族基因进行系统进化树分析,LcNCED2与调控苹果花瓣脱落MdNCED2、MdNCED4基因具有较高的同源性。Real-Time PCR表达分析发现,3个LcNCED基因在不同样品间表达存在显著差异,其中LcNCED2在各样品间的表达水平显著高于LcNCED1和LcNCED3,且LcNCED2表现出显著的组织特异性表达特点,花后15~75 d,LcNCED2在离区(果柄离层部位上下0.2 cm)中的表达量均高于种脐和果皮中,在花后45 d达到峰值,花后75 d稍有下降,基因表达的峰值略早于A4无核荔枝落果高峰期。而LcNCED1和LcNCED3在各组织样品中基因表达变化趋势规律不明显。上述结果表明,LcNCED2在离区中表达量变化比较符合A4无核荔枝生理落果趋势,推断LcNCED2基因可能与无核荔枝采前落果关系密切。

叶子花脱落酸生物合成关键酶基因NCED的克隆及调节开花功能初探

以叶子花品种‘大红宝巾’(Bougainvillea glabra‘Mrs Butt’)的2年生扦插苗为试验材料,克隆到了一个9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(NCED)同源基因,并分析了内源脱落酸(ABA)含量及NCED活性等变化与该基因表达之间的内在联系,探讨ABA对促进叶子花开花的作用机理。结果表明:(1)外源50mg·L-1 ABA处理促进了叶子花开花,而与10μmol·L-1的去甲二氢愈创木酸(NDGA,ABA合成抑制剂)共处理可抑制这种效果。(2)外源ABA处理可诱导叶子花叶片中内源ABA含量和NCED含量与活性上升,这种诱导可被NDGA抑制。(3)克隆得到的NCED基因全长为2 380bp,其推定的编码蛋白包含618个氨基酸残基,与草莓中的FvNCED1同源性最高,命名为BgNCED1。(4)Real-time PCR结果显示,外源ABA处理显著诱导BgNCED1基因的表达,而10μmol·L-1的NDGA可显著抑制BgNCED1基因的诱导效果,这种表达模式与内源ABA含量及NCED活性等的变化趋势较为一致。研究认为,外源ABA可能通过诱导BgNCED1的表达,增强内源ABA的生物合成,进而促进叶子花从营养生长到生殖生长的转变,使其提前开花。

不同矮化砧木对苹果树体生长及矮化相关基因表达的影响

以砧木Y系和SH40实生后代及嫁接的红富士苹果为试材,探讨了不同砧木对树体生长及矮化相关基因表达的影响,以期为深入研究苹果砧木致矮机理提供理论依据。结果表明:Y-1和2号砧木上品种树高分别为乔化对照的51%和65.5%。Y-1砧木在6-8月份的GA20ox1基因表达强度均显著低于对照,其上嫁接的品种8月份表达强度显著低于对照。NCED1基因在6月份的表达强度显著高于对照,7-8月份的显著低于对照;其上嫁接的品种7月份的表达强度显著高于对照,而8月份的显著低于对照。在7-8月份2号砧木及嫁接品种GA20ox1基因和NCED1基因的表达强度均显著低于对照。

白花泡桐NCED基因家族分析及其对丛枝植原体的响应

【目的】研究NCED家族基因在泡桐丛枝病发生过程中的作用。【方法】基于白花泡桐(Paulownia fortune)基因组图谱,采用生物信息学方法对白花泡桐NCED(PfNCED)家族进行成员鉴定,系统进化、基因结构和启动子顺式作用元件进行分析,并结合转录组、实时定量PCR和互作蛋白预测等方法筛选与丛枝病发生相关基因。【结果】发现PfNCED家族共有28个基因,分布在8条染色体上;进化树分析结果表明该家族基因可以分为4组,与拟南芥的同源性较高;共线性分析发现该家族发生5次片段复制事件;顺式作用元件表明PfNCED可能响应植物激素处理和环境胁迫。结合丛枝病发生前后的转录组分析,发现7个差异PfNCED可能与泡桐丛枝病发生相关;进一步的蛋白互作网络分析发现PfNCED16可能在丛枝病腋芽形成中发挥重要作用。【结论】白花泡桐中有28个PfNCED基因,其中PfNCED16可能在白花泡桐丛枝形成过程中发挥重要作用。

拟南芥ABA生物合成基因NCED6对葡萄糖诱导其种子萌发延迟的作用

抑制ABA的生物合成可以缓解葡萄糖抑制拟南芥种子萌发作用,说明ABA的生物合成参与葡萄糖诱导种子萌发的延迟。ABA生物合成基因9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶6(NCED6)可以被不同浓度的葡萄糖上调表达,而nced6突变体的种子对葡萄糖不敏感。

外源ABA对叶子花开花及内源ABA合成关键酶的影响

以叶子花‘大红宝巾’(Bougainvillea glabra‘Mrs Butt’)为试材,研究外源脱落酸(ABA)对其开花及其生物合成关键酶含量与活性变化的影响。结果表明:外源ABA对叶子花的成花有促进作用;去甲二氢愈创木酸(NDGA)浓度大于10μmol·L-1时,ABA的合成明显被抑制,低浓度NDGA与高浓度ABA共同作用反而对内源ABA含量的升高具有增效作用;内源ABA的变化趋势与9–顺式–环氧类胡萝卜素双氧合酶(NCED)含量的变化趋势相一致,表明NCED为ABA生物合成途径中的限速酶;外源ABA使玉米黄质环氧化酶(ZEP)、NCED、ABA醛氧化酶(AAO)含量及活性均明显上升,表明ABA能自我催化调节其合成,且单一酶基因或单一酶促反应并不能合理解释ABA水平的变化,推测ABA信号的作用机制是一个由多酶有机统筹系统控制的结果。

辣椒脱落酸合成相关酶基因的鉴定与表达分析

类胡萝卜素裂解双加氧酶基因家族的9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是脱落酸合成的关键酶类。利用生物信息学方法,鉴定辣椒脱落酸合成相关酶家族基因,并对基因结构、进化、功能和时空表达进行分析。研究发现,辣椒基因组中包含3个NCED基因和6个CCD基因,NCED基因不含内含子,CCD基因含有多个内含子;归为5个聚类组,与同为双子叶植物的拟南芥基因亲缘关系较近;CaNCED1具有与VP14类似的三维结构和催化基团;基因启动子区发现多个激素响应元件、环境胁迫响应元件;CaNCED1、CaCCD1a和CaCCD1b在辣椒各器官和果实成熟的各阶段均显示较高表达。该研究为辣椒ABA合成相关酶基因的功能分析和遗传育种应用提供了科学依据。

西瓜NCED基因的鉴定及其对枯萎病和脱落酸的表达模式分析

脱落酸(abscisic acid,ABA)是植物生长发育和逆境胁迫所必需的一种重要的植物激素,而9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是催化植物ABA合成的关键限速酶,在植物对干旱、高盐及病原菌等逆境的响应过程中发挥十分重要的作用。然而,目前还没有报道对西瓜中的ClNCED基因进行分离和鉴定。本研究在西瓜基因组中利用生物信息学技术共鉴定出10条ClNCED基因,预测并分析了这10条ClNCED基因的基因结构、染色体位置、亚细胞定位等基本信息及在西瓜不同组织器官、ABA和枯萎病处理下的表达模式。亚细胞定位预测发现大部分西瓜ClNCED蛋白主要被定位在叶绿体和细胞质中。利用不同物种的NCED蛋白进行进化分析发现西瓜ClNCED蛋白聚类在5个亚族中。亚族Ⅳ是西瓜特异亚族,只包含一对串联重复基因ClNCED09和ClNCED10编码的蛋白。在所有西瓜ClNCED基因中,只有一半有内含子,内含子数由5~12不等。另外,我们还利用荧光定量PCR(RT-qPCR)对ClNCED基因的时空表达模式进行分析,发现一半的西瓜ClNCED基因为特异表达基因,并且大部分在雄花中优势表达。此外,我们从ClNCED基因的启动子中发现了许多重要的顺式作用元件,这些元件与激素和逆境相关,对西瓜ClNCED基因在喷施ABA及接种尖孢镰刀杆菌后的表达水平进行分析,发现绝大部分ClNCED基因能响应ABA处理,同时还鉴定到多个响应枯萎病的ClNCED基因,这也为今后西瓜ClNCED基因的功能鉴定及相关的抗病分子育种提供重要的理论依据。