猪链球菌种与9型猪链球菌二重PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种与9型猪链球菌(SS9)的快速诊断方法,本研究根据GenBank已登录的SS种特异性基因gdh和SS9型特异性基因CPS9H设计引物,以标准SS9株基因组DNA为模板,建立了SS种和SS9的二重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的方法对检测疑似猪链球菌感染猪临床样品,并与常规细菌分离鉴定方法进行了比对。结果表明成功建立SS种和SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100个CFU,特异性和重复性好;利用该方法对34份临床分离自疑似猪链球菌感染样品的细菌培养物进行了应用检测试验,其中有11份样品为gdh阳性,11份gdh阳性样品中有3份样品同时为SS9阳性。本研究成功建立了SS种与SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,可用于猪链球菌种和SS9型猪链球菌的快速诊断。

9型猪链球菌广东株的分离鉴定和基因序列分析

为了解9型猪链球菌广东分离株毒力因子基因型、基因变异和进化情况,本试验采集发病猪脑脊液、关节液、脾脏、肝脏、淋巴结进行细菌分离培养和生化鉴定,采用PCR方法鉴定其血清型及部分毒力基因,对cps9D、gdh、gapdh与orf2基因进行序列测定和分析,并构建系统发育树。结果显示,分离菌镜检为革兰氏阳性链状球菌,在鲜血琼脂平板中呈β溶血,可发酵大多数糖类,能成功扩增cps9D基因,含重要的保守基因gdh及毒力基因gapdh和orf2,表明分离菌株为9型猪链球菌。分离菌株cps9D、gdh、gapdh、orf2基因核苷酸序列与GenBank上国内外参考菌株的同源性分别为95.9%~100.0%、98.6%~99.8%、98.7%~99.6%和95.5%~99.9%,说明分离菌株与国内外其他9型猪链球菌毒株核苷酸同源性都较高,且与国内外的流行毒株基本一致,未发生太大的变异。系统发育树表明,分离株与国内外来源不同的猪链球菌分离株同源性高,亲缘关系密切。

猪链球菌9型菌株的分离鉴定

为了确诊四川省某猪场1头25日龄左右的后腿跛行并急性死亡仔猪的病因,并制定对猪群其他猪只的预防和治疗方案。本试验剖检死亡仔猪,取脾脏、肝脏、肺脏组织和血液进行细菌分离培养,革兰染色镜检,PCR分型鉴定和药敏试验。结果显示,分离培养的细菌革兰染色为阳性;分离菌株经PCR检测为猪链球菌9型;药敏试验确定该分离菌株对氨苄西林、环丙沙星、氟苯尼考、青霉素、多西环素、头孢氨苄、氧氟沙星、头孢拉定、头孢呋辛和氯霉素敏感。结果表明,该猪场仔猪为感染猪链球菌9型引起的急性死亡,通过头孢类等药物可以有效的治疗发病仔猪。

猪链球菌2型和9型广东分离株的病原特性

2005年夏秋季从广东地区9例病猪中分离到2株猪源链球菌,均呈链球菌的特征形态,α溶血,生化试验结果相似,且都不与A^G链球菌群特异性血清发生凝集。经PCR及测序鉴定,一株为猪链球菌2型,另一株为猪链球菌9型。2型分离株的3个毒力基因均为阳性(sly+epf+mrp+),但对小鼠的毒力较低,2/10小鼠在接种细菌后第6~15 d发病致死,细菌在小鼠中的带菌时间至少15 d;9型分离株3个毒力因子均阴性(sly-epf-mrp-),但对小鼠有较强毒力,9/10小鼠在接种细菌后5 d内发病死亡,对小鼠的半数致死量为1.70×106CFU。表明广东地区致病性猪链球菌不仅存在2型,而且还有9型。

猪链球菌9型荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复性试验;利用所建立的检测方法对河南省11例疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了对比。【结果】成功建立了SS9的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1.0拷贝/μL,特异性高且重复性良好;利用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染组织病料进行的应用检测表明,其中有3份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。【结论】成功建立的SS9 FQ-PCR诊断方法,可用于临床SS9型病菌感染的快速诊断及样品中细菌含量的定量分析。

猪链球菌9型cps9G基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪链球菌9型（SS9）基因的核酸序列，设计一对引物，采用PCR方法从确诊为猪链球菌的阳性样品中扩增cps9G基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上，转化DH5a感受态细胞，提取重组质粒pMD18T-cps9G，经PCR和酶切鉴定后测序，并与GenBank上SS9相应序列进行同源性分析。结果表明，经PCR扩增，鉴定为SS9的有8株。序列分析发现，8株SS9的cps9G片段的核苷酸序列较稳定，该基因片段长度均为562bp，彼此间的核苷酸同源性达96．8％～99．8％，亲缘关系密切；与GenBank上已发表的SS9参考毒株的同源性介于96．0％～98．6％。

正常屠宰猪致病性猪链球菌9型的鉴定和特性研究

从江苏某地正常屠宰猪扁桃体分离到1株细菌HA070725,呈链球菌的特征形态,β溶血,药敏试验表明该菌对多种抗生素产生耐药性。经PCR及序列分析,为猪链球菌9型。其毒力因子基因型为mrp-/epf-/sly-/orf2+/gdh+/ fbps+/impdh+。动物致病性试验表明,该菌对ICR小鼠和断奶仔猪有较强的致病性,对ICR小鼠的半数致死量为2.67×10~6cfu。结果表明:在正常猪扁桃体中可携带高致病性的猪链球菌9型。

猪链球菌9型国内分离株毒力基因的检测及小鼠免疫试验

通过检测7株猪链球菌9型(SS9)国内分离株的毒力基因,比对7株SS9荚膜合成基因cps9j的300 bp碱基序列,以及进行7株SS9对小鼠的毒力试验和免疫保护试验,初步探讨了国内SS9的毒力特性。结果显示,7株SS9均缺失胞外因子(epf)和溶血素(sly)基因,溶菌酶释放蛋白基因(mrp)存在于GZ0665和GD0606株,orf2仅存于GZ0665株;病猪脑脊液分离株GZ0665与从健康猪扁桃体分离的6株SS9的cps9j同源性低;在7株SS9分离株和SS2分离株HA9801中,只有GZ0665和GD0606株能致死小鼠;用灭活的GZ0665菌株免疫的小鼠对同源菌株GZ0665及GD0606株攻击的保护率均为100%(10/10),用灭活的GD0606和未灭活的GD0627菌株免疫的小鼠对GD0606株攻击的保护率分别为80%(8/10)和50%(5/10),而对GZ0665株攻击的保护率分别为60%(6/10)和30%(3/10)。证实,SS9病猪脑脊液分离株的毒力基因有别于SS9健康猪扁桃体分离株和SS2。表明,小鼠可以用来区分SS9病猪脑脊液分离株与健康猪扁桃体分离株的致病力。

猪链球菌9型钦州分离株cps9H基因序列分析

根据已发表的猪链球菌9型（SS9）荷兰5218分离株的基因核苷酸序列保守区域，设计一对特异性引物，以SS9钦州分离株抽提的DNA为模板，通过PCR方法扩增eps9H基因片段，并对其进行克隆、测序和分析。结果表明，4株SS9钦州分离株的cps9H目的基因长为389bp，与已知的7个国内外SS9毒株cps9H基因片段的核苷酸及推导的氨基酸序列比较，同源性分别为96．7％-100％和91．5％～100％。

猪链球菌9型分离株的耐药性及耐药基因分析

目的了解猪链球菌9型(Streptococcus suis serotype 9,SS9)的耐药性和耐药基因情况。方法采用药敏纸片扩散法检测15株SS9菌株对9类21种不同抗生素的耐药性,并通过PCR方法检测其大环内酯类及四环素类耐药基因的携带情况。结果被检菌株对大环内酯类及林可胺类耐药率都为100%,对四环素及链霉素的耐药率都为93.3%,对头孢类、氯霉素类、阿莫西林、糖肽类以及庆大霉素较为敏感。所有菌株均耐7种及以上抗菌药物,最高可耐16种,其中以8重耐药的菌株数量最多。不同地区SS9分离株对抗生素耐药情况不同,健康猪分离株耐药情况较病猪分离株更为严重。100%的菌株具有ermB基因,93.33%的菌株具有tetO基因,表明ermB和tetO分别可能是介导SS9对大环内酯类及四环素产生耐药性的主要原因之一。结论本研究为猪链球菌9型的预防和临床治疗、耐药性及耐药机制的研究提供了参考依据。

猪链球菌9型引起的猪脑膜脑炎型链球菌病病例报告

猪脑膜脑炎型链球菌病是严重危害断奶后仔猪的一种多发病。2017年11月,南昌市新建区厚田镇一养猪户所饲养的断奶后仔猪发生这种疾病,通过细菌分离和分离菌的血清学鉴定,确定该病由猪链球菌9型引起。鉴于江西省这方面的报告不多,特总结报告如下,供养猪户防控该疾病参考。1发病情况该养猪户饲养60头母猪,自繁自养商品猪出售。2017年11月3日,40kg左右的断奶小猪360多头有的突然发病,一天死亡3头,还有2头倒地,主要表现神经症状,而后连续几天都有仔猪死亡。应用复方阿莫西林给发病猪群饮水,病情很快得到控制。该次发病共死亡17头猪。

猪链球菌血清9型菌株分离鉴定及强毒株筛选

为了筛选猪链球菌血清9型(SS9)强毒株并研究其生物学特性,对全国各地发病猪的病料中进行猪链球菌分离培养。通过形态学观察、革兰氏染色镜检、PCR鉴定及血清型分型确定了29株猪链球菌血清9型菌株,分别命名为SS9-1~SS9-29。通过玉米大蜡螟幼虫和Balb/c小鼠对29株猪链球菌血清9型菌株进行初筛和复筛,筛选出2株猪链球菌血清9型强毒株,分别为SS9-20、SS9-22。为进一步了解SS9-22的生物学特性,对其进行生长曲线绘制、毒力基因检测及小鼠致病性试验。结果显示,SS9-22菌株在37℃培养6 h时,菌液密度可达到最高值。毒力基因检测发现SS9-22的毒力基因型为gapdh^(+)/sly^(+)/fbps^(^(+))/orf2^(+)/mrp﹣/89K﹣/gdh^(+)/epf^(+)。SS9-22菌株经腹腔接种Balb/c小鼠,24 h内可引起小鼠精神萎靡、扎堆、被毛耸立、运动迟缓、死亡等临床症状,该菌株的LD50为3.2×10^(7)CFU,表明该菌株为强毒株。研究结果丰富了猪链球菌的菌种库,为猪链球菌血清9型的防控提供研究材料,为后续猪链球菌9型的致病机制研究及疫苗的开发奠定了基础。

猪链球菌9型钦州株的分离及其cps9H基因序列分析

对临床疑似猪链球菌9型（SS9）的病料进行实验室诊断。通过实验室检测结果证实,分离菌属于SS9,将其命名为QZ49;扩增其cps9H目的基因长为389 bp;与GenBank上国内外SS9毒株核苷酸同源性介于97.2%-99.5%之间。

天津地区猪链球菌9型分离株致病性的研究

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌株携带的主要毒力基因、黏附力试验和溶血性试验等,对分离株的致病能力、基因特性、黏附能力和溶血能力等进行了研究。结果显示,8株9型猪链球菌分离株对昆明小鼠的LD50差异较大,最小值6.4×10^6 CFU/mL,最大值为5.7×10^8 CFU/mL;受试菌株中gdh、cps9J、gapdh、fbps、orf2、mrp、sly和ef基因的检出率依次为100.0%、100.0%、62.5%、50.0%、37.5%、0.0%、0.0%和0.0%,分为5种毒力基因型,毒力基因型与菌株对昆明鼠的致病能力无直接关系。8株9型猪链球菌对PK-15细胞均具有黏附作用,黏附能力为1.2×10^3~3.9×10^4CFU/mL,其中CHTJS55菌株最强,CHTJS9-ZL次之,CHTJS72S最弱。溶血性试验结果表明,随着孵育时间的增长,各菌株的溶血能力均增强,且孵育3 h时,CHTJS41菌株的溶血能力最强,CHTJS70菌株最弱。上述研究结果为临床制定合理、有效的猪链球菌病防控措施以及候选疫苗株的筛选提供了参考依据。

DNA核酸酶与猪链球菌9型毒力的关系

【目的】除了猪链球菌2型外,猪链球菌9型(SS9)也是目前流行血清型,同时也是人畜共患病原菌。前期研究发现,DNA核酸酶(Ssn A)存在于SS9毒力株中,在SS9无毒株中不存在。为明确Ssn A对SS9毒力的影响,本研究构建ssn A缺失株Δssn A,并研究其生物学功能。【方法】用穿梭质粒p SET-4s构建Δssn A,并通过斑马鱼毒力试验、HEp-2细胞黏附、猪全血存活和酶活检测等试验,评价Ssn A对SS9毒力的影响。【结果】斑马鱼毒力试验显示,Δssn A对斑马鱼毒力显著降低,半数致死量是野生株的11.2倍;Δssn A对HEp-2细胞的黏附率为野生株的60.61%;Δssn A在猪全血中的存活率为野生株的71.88%;酶活试验表明,Ssn A可降解线性和环状DNA。【结论】本研究表明SS9 Ssn A具有降解线性和环状DNA能力,该基因缺失后细菌对斑马鱼毒力、黏附HEp-2细胞能力、在猪全血中存活及分解DNA能力都显著降低,证实Ssn A是SS9的一个毒力因子。

猪链球菌9型GZ0565株体外传代的生物学稳定性

选取猪链球菌9型(SS9)GZ0565株连续传代培养至20代(S1～S20代),用API20Strep生化鉴定试剂条和全自动生化分析仪对各代次之间进行了比较鉴定。生化试验结果表明,GZ0565株传代稳定性好。以特殊品系的黑色小鼠C57BL/6作为SS9感染的动物模型,经腹腔注射接种S1、S5、S10、S15和S20代不同稀释度菌液,统计1周内小鼠的死亡数量。结果显示,攻毒后死亡的小鼠具有典型的细菌性败血症病理变化,肝及脑内可分离到革兰氏阳性球菌,短链状,绵羊血平板上呈β溶血,经PCR检测,从死亡小鼠体内分离的细菌与攻毒菌株为同一种细菌。S1、S5、S10、S15和S20代菌株对小鼠的LD50分别为3.63×108、6.03×108、2.63×109、1.45×109和8.7×1010。证明SS9GZ0565株经过20代传代培养后毒力相对稳定,可作为疫苗候选株。

猪链球菌9型ICR小鼠感染模型的建立及评分

为验证小鼠是否可以替代猪作为猪链球菌9型的感染动物模型并做评分。将32只9周龄ICR小鼠随机分成5个攻毒组（每组6只）,1个PBS对照（2只）,计算LD50,观察小鼠的临床症状及脏器病变并评分;分离细菌做镜检及PCR鉴定。结果显示,LD50为3.92×109CFU;2.2×1010组小鼠意识消沉,腹泻、失明、食欲下降,临床症状分数最高为3分;肝肿大,内脏严重出血,病变评分为3~4分。其余组小鼠分数随着攻毒剂量的下降而降低。从病变组织中均分离到该病菌,鉴定为阳性。由临床症状及病理评分确定,ICR小鼠可作为猪链球菌9型的感染动物模型。