表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

9型重组腺相关病毒转染体外培养大鼠心肌细胞的影响

目的:研究含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的9型重组腺相关病毒(rAAV9)对大鼠心肌H9C2细胞的转染及对细胞生长的影响。方法:rAAV9-EGFP按转染复数(MOI)1×105、1×106、1×107转染H9C2细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察H9C2细胞中EGFP阳性表达情况,采用流式细胞仪检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染效率。观察转染后细胞生长形态,并用AlamarBlue法检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖影响。结果:转染后第1天,MOI=1×106、1×107组中EGFP开始表达;第2天,MOI=1×105组开始表达,各组EGFP表达强度随MOI值的增高而增强,同时EGFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强;转染后第4天达到高峰,此时流式细胞术检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染率分别为MOI=1×105组:(14.1±0.2)%、MOI=1×106组:(35.1±4.8)%、MOI=1×107组:(56.8±0.1)%。rAAV9-EGFP转染H9C2细胞后,细胞生长及形态正常,AlamarBlue法进一步检测表明转染组对H9C2细胞增殖无影响。结论:rAAV9-EGFP能够有效地转染H9C2细胞,且rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖无明显抑制。

鸡血清4型禽腺病毒与HH9亚型禽流感病毒亚型禽流感病毒、新城疫病毒混合感染的鉴定

试验对临床疑似血清4型禽腺病毒与H9亚型禽流感、新城疫混合感染鸡的病例进行了病毒分离与鉴定。通过接种鸡胚、血凝和血凝抑制试验、琼脂扩散试验、PCR鉴定,确定该病例为三种病毒混合感染。动物回归试验证明,1 000 ELD_(50)病毒量对2日龄SPF鸡致死率达到100%,剖检病变呈现典型心包积液-肝炎综合征,而H9亚型禽流感和新城疫病变特征不明显,说明混合感染中血清4型禽腺病毒病变非常典型,H9亚型禽流感和新城疫则呈现非典型病变。

9型腺相关病毒转染乳鼠心肌细胞的可行性及安全性

背景：9型腺相关病毒对心肌细胞具有更好的靶向转染,是目前研究基因治疗心脏疾病的理想载体。目的：探索9型腺相关病毒体外转染乳鼠心肌细胞的可行性及对乳鼠心肌细胞的毒性评估。方法：分离培养原代乳鼠心肌细胞,以携带荧光蛋白基因的9型腺相关病毒为载体,将分离纯化的乳鼠心肌细胞分为正常培养组、无病毒转染组、病毒转染组。结果与结论：第1周细胞搏动频率及百分率正常培养组和病毒转染组与无病毒转染组比较,差异无显著性意义（P〉0.05）,但正常培养组高于病毒转染组（P〈0.05）;3周后各组比较,差异无显著性意义（P〉0.05）。经9型腺相关病毒转染的心肌细胞24h开始有表达,4~6d荧光最强,3组细胞72h内不同时间点还原比率均接近于1.0。说明9型腺相关病毒能成功有效地转染乳鼠心肌细胞,对乳鼠心肌细胞无明显毒性作用。

表达Kallistatin的9型重组腺相关病毒的制备及其体外表达效率

采用三质粒磷酸钙共转染生产系统,制备出可以表达内源性抗肿瘤血管生成因子(Kallistatin)的9型重组腺相关病毒(rAAV2/9)和2型重组腺相关病毒(rAAV2/2).rAAV经银染法鉴定其纯度;采用WesternBlotting法比较rAAV2/9和rAAV2/2外壳蛋白的大小;qPCR方法检测rAAV的滴度.使用rAAV2/9-Kal-listatin和rAAV2/2-Kallistatin分别感染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)后,RT-PCR和ELISA法分别检测Kallistatin的mRNA和蛋白表达水平.结果表明:纯化的病毒纯度达到98%以上;rAAV9外壳蛋白比rAAV2的大.感染HUVEC后,rAAV2/9介导Kallistatin在mRNA和蛋白表达水平都要比rAAV2/2高.

9型重组腺相关病毒转染microRNA-21前体在大鼠心肌的转染效率及安全性

目的研究含荧光标记ZsGreen的9型重组腺相关病毒(rAAV9)转染目的基因microRNA-21前体(pre-miR-21)至大鼠心肌的转染效率、表达时间及安全性。方法用冠脉注射方法转染PBS及rAAV9-Zs-Green-pre-miR-21 1.0×1010vg/只、1.0×1011vg/只、1.0×1012vg/只至SD大鼠心肌,倒置荧光显微镜观察心肌组织荧光表达并计算转染效率,Realtime PCR方法测定miR-21表达,超声心动图观察大鼠心功能。结果冠脉注射后7 d PBS组未见绿色荧光,余各组大鼠心肌均可观察到少量绿色荧光表达,第14天达高峰,之后呈下降趋势。14 d高病毒量组较其他中、低病毒量组转染效率明显高([73.7±8.4)%vs(39.6±4.8)%,(P<0.001)];([73.7±8.4)%vs(24.1±4.2)%,(P<0.001)]。14 d miR-21表达在低、中、高病毒量组较PBS组分别增加1.51倍、2.89倍及4.43倍。rAAV9转染后对大鼠心功能无影响(P>0.05)。结论 rAAV9-Zs-Green-pre-miR-21可以有效、持久、安全地在大鼠心肌表达。

9型腺相关病毒携带IL4对阿尔兹海默病模型大鼠学习记忆能力的影响

目的探讨过表达白细胞介素4(IL4)的9型腺相关病毒(AAV9-IL4)对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠在Morris水迷宫行为学测试中学习记忆的影响。方法75只SPF级SD大鼠,雄性,利用海马区注射Aβ1-42制作的AD模型;将模型随机分为实验组39只、对照组36只,尾静脉注射包装并测定好滴度的腺相关病毒(AAV9-IL4与AAV9空载对照),实验组大鼠尾静脉给予5μl AAV9-IL4注射,对照组大鼠给予等同剂量的AAV9空载注射。术后2 w,4 w,8 w分别采用Morris水迷宫测试,记录大鼠逃避潜伏期、经过原隐藏平台的次数以及大鼠在第1象限游泳时间占总体游泳时间的百分比。结果IL4-AAV9组SD大鼠逃逸潜伏期明显低于AAV9组SD大鼠(P<0.001)。IL4-AAV9组SD大鼠单位时间平均穿越平台次数显著高于AAV9组(F=109.23 P<0.001),且2 w、4 w差异显著,4 w、8 w无明显差异。IL4-AAV9组SD大鼠单位时间目标象限游泳时间占总时间比显著高于AAV9组,且2 w、4 w无明显差异,4 w、8 w差异显著。结论IL4-AAV9能够显著改善SD大鼠的空间学习记忆能力。

过表达HGF基因AAV9型腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建稳定表达肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因重组腺相关病毒过表达质粒载体,制备并纯化HGF过表达的高滴度重组腺相关病毒。方法合成HGF基因并利用PCR扩增,退火形成双链,与pAAV-ITR-CMV质粒经XhoⅠ单酶切连接构建质粒pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF,转化至大肠杆菌DH5α,提质粒后经酶切和测序鉴定证实重组质粒克隆正确,将重组质粒转染至293FT细胞中包装为腺相关病毒。小鼠注射病毒后通过Western blot法评价HGF的蛋白表达水平。结果扩增产物包含HGF CDS全序列的2186 bp,酶切结果与测序结果说明PCR扩增HGF目的片段成功;实时荧光定量PCR检测结果显示,纯化后所得的过表达HGF的腺相关病毒滴度为5.22×10^(12) vg·mL^(-1);HGF过表达组HGF蛋白相对表达含量较生理盐水组与阴性对照组均升高(P均<0.01)。结论本研究成功构建了HGF腺相关病毒载体且病毒滴度达到普通动物注射要求,证明腺相关病毒载体构建成功。

9型腺相关病毒介导RNA干扰抑制p65基因表达对血管紧张素Ⅱ诱导H9c2细胞凋亡的影响

目的:以9型腺相关病毒(AAV9)介导的RNA干扰抑制大鼠心室肌H9c2细胞中p65基因表达,研究其在血管紧张素II(Ang II)诱导下对H9c2细胞凋亡的影响,并阐明其可能机制。方法:分别将r AAV9-eGFP及r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA按转染复数(MOI)=4×106vg/cell转染至H9c2细胞,在荧光倒置显微镜下观察e GFP的阳性表达情况,采用流式细胞术检测其转染效率,并用Western blot法分析p65的表达情况。CCK-8法检测病毒对H9c2细胞活力的影响。流式细胞术分析各组细胞的凋亡情况。结果:病毒转染48 h后e GFP开始有表达,并且表达强度随着时间延长而增加,第5天达最高值,此时流式细胞术检测转染率为(52. 7±1. 9)%。与空白组相比,转染病毒后H9c2细胞的活力无明显变化。静息状态下H9c2细胞的NF-κB p65有一定活性,给予Ang II刺激后NF-κB p65的活性明显增高,而转染r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA可有效抑制NF-κB p65的活性。流式细胞术检测发现Ang II刺激组的凋亡程度明显高于空白组,而r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA组的细胞凋亡明显受到抑制。结论:通过r AAV9介导的RNA干扰能有效抑制H9c2细胞NF-κB p65基因的表达;抑制p65基因表达对H9c2细胞活力无明显抑制,但能减少Ang II诱导下的细胞凋亡。

重组9型腺相关病毒载体转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉:最佳在体表达时间点的确定

背景:重组9型腺相关病毒载体对心肌组织具有较高的亲和力,关于携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9-enhanced green fluorescent protein,r AAV9-e GFP)在动脉粥样硬化模型小鼠主动脉中的表达情况还不确定。目的:探索携带r AAV9-e GFP转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉最佳的在体表达时间点。方法:给予30只Apo E-/-小鼠连续高脂饮食饲养16周建立为动脉粥样硬化模型,然后随机取其中25只通过尾静脉注射转染5.0×1011 vg(virus genomes)r AAV9-e GFP,另5只作为对照组给予生理盐水。转染病毒的动脉粥样硬化模型小鼠分别于转染后14,21,28,35,60 d处死,留取主动脉组织,应用激光共聚焦显微镜观察增强型绿色荧光蛋白荧光表达情况,Western blot法检测主动脉增强型绿色荧光蛋白的蛋白表达,观察增强型绿色荧光蛋白体内表达情况,确定病毒在体表达最佳时间点。结果与结论:r AAV9-e GFP可有效转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉血管,增强型绿色荧光蛋白可在主动脉组织中表达,其表达强度随着转染时间的增加而逐渐增强,于转染35 d时表达最强,60 d趋于稳定,各时间点主动脉斑块中增强型绿色荧光蛋白表达的水平差异有显著意义(P<0.001)。表明r AAV9-e GFP可有效在动脉粥样硬化模型Apo E-/-小鼠主动脉中表达,r AAV9-e GFP可成为动脉粥样硬化治疗的最佳载体。

9型腺相关病毒经圆窗膜转导小鼠耳蜗两种方式的对比研究

目的通过圆窗膜显微注射和完整圆窗膜途径转导小鼠内耳携带GFP的9型腺相关病毒(adeno-asso-ciated virus,AAV),比较两种方式的可行性、转染效率以及对听力的影响。方法 18只C57BL/6小鼠,随机分为圆窗膜显微注射组和完整圆窗膜途径组,术前均行听性脑干反应(auditory brain response, ABR)测听,术后两周行ABR测听后取双侧耳蜗基底膜铺片及冰冻切片观察GFP表达情况。结果两种转导方法对小鼠听力均无显著影响,圆窗膜显微注射组转染耳蜗内毛细胞GFP可见表达,转染效率由底转到顶转逐渐降低,无毛细胞损伤,经完整圆窗膜途径转染耳蜗未见GFP表达。结论 9型AAV难以通过完整圆窗膜,通过显微注射方式能够将目的基因高效转导内耳,对内毛细胞有选择特异性,且对听力影响较小,是一种安全有效的内耳转导方式。

新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗对不同日龄雏鸡的免疫效力研究

为评估新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗的免疫效力,采用该疫苗分别免疫7、14、21日龄的SPF雏鸡和商品雏鸡,免疫后21 d采血测定新城疫病毒(NDV)HI、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)HI及禽腺病毒(FAdV)中和抗体,并用禽腺病毒(Ⅰ群,4型)强毒攻击。结果显示:免疫后各不同日龄免疫组SPF雏鸡的NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体效价分别为8.2 log2~8.5 log2、8.8 log2~9.6 log2和9.7 log2~10.3 log2,FAdV攻毒保护率均达到100%(10/10);21日龄SPF鸡免疫后3个月,试验鸡NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体分别达7.2 log2、7.8 log2和11.3 log2,FAdV攻毒保护率均为100%(10/10);不同日龄免疫组普通雏鸡NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体效价分别为6.7 log2~7.6 log2、7.9 log2~8.7 log2和9.8 log2~10.3 log2,FAdV攻毒保护率均达到100%(10/10)。表明该疫苗可对不同日龄SPF雏鸡和商品雏鸡产生良好的免疫力,对雏鸡免疫持续期达3个月。

重组9型腺相关病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞

背景:重组9型腺相关病毒对心肌细胞具有良好的亲和力,是目前研究基因治疗心肌梗死的理想载体。目的:观察携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒(r AAV9-e GFP)对小鼠骨髓间充质干细胞的转染效率。方法:将携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒以不同感染复数(1×105,1×106,1×107)转染体外培养的第4代小鼠骨髓间充质干细胞,并在转染后1-7 d连续用荧光倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞中增强型绿色荧光蛋白阳性表达情况,寻找最佳感染条件;采用流式细胞仪检测最佳感染复数下携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒对小鼠骨髓间充质干细胞的转染效率。结果与结论:转染后第1天,感染复数为1×107组可见增强型绿色荧光蛋白开始表达,转染后第2天,感染复数为1×105、1×106组开始表达;各组增强型绿色荧光蛋白表达强度随感染复数值的增高而增强,同时增强型绿色荧光蛋白的表达强度随着时间延长而逐渐增强;转染后第5天达到高峰,此时感染复数为1×107组转染效率约8%,结果表明携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组9型腺相关病毒对小鼠骨髓间充质干细胞转染效率较低。

人Carabin基因过表达的9型重组腺相关病毒的构建及功能鉴定

目的:构建人Carabin基因过表达的9型重组腺相关病毒,并对其进行结构和功能鉴定。方法:对目的基因质粒pUC57-carabin和载体质粒pAAV9-IRES-ZsGreen进行EcoRI+XhoI双酶切,在T4DNA Ligase作用下连接酶切产物,在JM109感受态细胞中筛选pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen质粒,将pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen质粒应用高效HET kit转染试剂盒转染至293AAV细胞,以包装rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相关病毒,利用Q-PCR检测病毒滴度。rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen感染人心室肌细胞株AC16,western blot检测carabin蛋白表达。结果:pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen过表达质粒构建成功,rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相关病毒包装顺利,滴度为5.09E+12 vg/mL,感染AC16后,carabin蛋白表达显著上调。结论:rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相关病毒构建成功,并在心肌细胞中具有高效表达carabin的效应。

经静脉注射的单链9型腺相关病毒介导基因在星形胶质细胞表达

目的·探讨静脉注射含低氧反应元件(hypoxia-responsive element,HRE)启动子的单链9型腺相关病毒(single-stranded adeno-associated virus serotype 9,ssAAV9)能否介导LacZ基因在脑缺血区表达,及其可转染的脑细胞类型。方法·建立永久性左侧远端大脑中动脉闭塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)小鼠模型,模型建立1 d和5 d后检测脑缺血区中低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)的表达。dMCAO模型建立1 h经颈静脉注射AAV9-H9LacZ载体,注射5 d后X-gal染色检测脑缺血区和肝组织中LacZ基因编码蛋白β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)的表达,免疫荧光双染色检测β-gal在星形胶质细胞、神经元及血管内皮细胞内的表达。结果·dMCAO模型建立1 d和5 d后小鼠缺血病灶局部HIF-1表达增高。β-gal主要在AAV9-H9LacZ注射小鼠的缺血半暗带区表达,其肝脏组织无β-gal阳性表达。脑缺血区β-gal主要与胶质细胞原纤维酸性蛋白共表达,少量β-gal与神经元特异核蛋白共表达。结论·经静脉注射的ssAAV9主要介导基因在脑缺血区星形胶质细胞表达。HRE能有效控制LacZ基因主要在脑缺血区表达。

海兰褐蛋鸡4型禽腺病毒与H9N2亚型禽流感病毒混合感染的诊治

山东某养鸡场养殖的海兰褐蛋鸡4 000只,54日龄开始发病,鸡群表现精神沉郁,排绿色、黄绿色稀粪,有的出现呼吸道症状,大多数鸡只无明显症状突然出现死亡,剖检病死鸡主要病变为心包积液,肝脏出血、破裂,肺脏出血、淤血,气囊浑浊,死亡率可达1%~5%。采集病料进行实验室检测,根据检测结果并结合临床诊断,该病例最终确诊为血清4型禽腺病毒与H9N2亚型禽流感病毒混合感染。对该鸡群进行抗体治疗,同时结合对症疗法,及时控制了病情。

9型腺相关病毒携带IL4对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力的影响

目的:探讨过表达白细胞介素4的9型腺相关病毒(AAV9-IL4)对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠在Morris水迷宫行为学测试中学习记忆的影响。方法:75只SPF级SD大鼠,雄性,利用海马区注射Aβ1-42制作的AD模型;将模型随机分为实验组39只、对照组36只,尾静脉注射包装并测定好滴度的腺相关病毒(AAV9-IL4与AAV9空载对照),实验组大鼠尾静脉给予5μLAAV9-IL4注射,对照组大鼠给予等同剂量的AAV9空载注射。术后2周、4周、8周分别采用Morris水迷宫记录大鼠逃避潜伏期、经过原隐藏平台的次数以及大鼠在第1象限游泳时间占总体游泳时间的百分比。结果:IL4-AAV9组SD大鼠逃逸潜伏期明显低于AVV9组SD大鼠(P<0.001)。IL4-AAV9组SD大鼠单位时间平均穿越平台次数显著高于AVV9组(F=109.23P<0.001),且2周、4周差异显著,4周、8周无明显差异。IL4-AAV9组SD大鼠单位时间目标象限游泳时间占总时间比显著高于AVV9组(F=675.56P<0.001),且2周、4周无明显差异,4周、8周差异显著。结论:IL4-AAV9能够显著改善Aβ1-42阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力。

人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备

目的:制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法:酶切pMD18TNP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrackCMVNP9载体,线性化后与pAdEasy1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组的pADNP9病毒载体。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果:酶切鉴定得到阳性pADNP9重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强。结论:成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。

荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒对前列腺癌细胞增殖及侵袭作用的影响

目的研究荷载精子相关抗原9（sperm associated antigen 9，SPAG9）基因shRNA的溶瘤腺病毒对人前列腺癌细胞株PC-3和DU145增殖及侵袭作用的影响，并初步探讨其作用机制。方法采用同源重组法构建溶瘤腺病毒ZD55-SPAG9，采用PCR法进行鉴定。荧光显微镜观察病毒转染情况。CCK-8法检测溶瘤腺病毒对细胞增殖的作用。结晶紫法观察溶瘤腺病毒的细胞毒性。Transwell检测溶瘤腺病毒对细胞侵袭作用的影响。Western blot检测溶瘤腺病毒处理后PC-3和DU145细胞中SPAG9、E-cadherin、Vimentin和MMP-2蛋白的表达。结果溶瘤腺病毒ZD55-SPAG9包装成功，在PC-3和DU145细胞转染情况良好。ZD55-SPAG9对前列腺癌细胞增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性。随着病毒滴度的增加，ZD55-SPAG9对PC-3和DU145细胞的毒性逐渐增加。与PBS组和ZD55-EGFP组比较，ZD55-SPAG9组侵袭的PC-3和DU145细胞数目明显减少，差异有统计学意义（P〈0．01）。与PBS组和ZD55-EGFP组比较，ZD55-SPAG9组PC-3和DUl45细胞中SPAG9、MMP-2、Vimentin蛋白表达量显著降低，E-cadherin蛋白表达升高，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论ZD55-SPAG9能够显著抑制人前列腺癌PC-3和DU145细胞的增殖和侵袭能力，其机制可能与上皮细胞间质化有关。