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CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床研究中的伦理审查问题探讨 被引量:14
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作者 周吉银 刘丹 +1 位作者 曾圣雅 周来新 《中国医学伦理学》 2017年第8期927-931,共5页
目的探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床研究中引发的伦理审查问题,为临床研究中涉及该技术的伦理审查注意事项提供参考。方法总结国内外CRISPR/Cas9基因编辑技术存在的伦理问题,分析其原因并提出符合我国国情新技术应用的建议。结果应... 目的探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床研究中引发的伦理审查问题,为临床研究中涉及该技术的伦理审查注意事项提供参考。方法总结国内外CRISPR/Cas9基因编辑技术存在的伦理问题,分析其原因并提出符合我国国情新技术应用的建议。结果应该允许将基因编辑技术应用于体细胞基因治疗,禁止用于生殖系基因治疗和不考虑用来增强;鉴于CRISPR/Cas9缺乏明确的责任伦理主体,带来安全性、权利冲突和社会公平问题,需采取的措施包括加强文化沟通、尽快形成基因编辑技术伦理规范、在国家层面上设立独立的基因编辑技术项目伦理审查机构、健全法律规范、制定技术标准和伦理准则以及在国家层面应对基因编辑研究领域进行重点支持。结论鉴于CRISPR/Cas9技术潜在的临床应用,国家应逐步从禁止到限制性开展人类胚胎基因编辑技术的研究。伦理委员会要负起临床研究的伦理审查和监管。伦理委员会委员和伦理工作人员应加强相关新知识的学习,从受理涉及CRISPR/Cas9技术的临床科研项目到伦理审查都严格对接政策法规,确保有效审查基因编辑技术项目的伦理问题。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术 临床研究 伦理审查
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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 StxⅡ基因表达
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作者 樊欢 吴涛 +6 位作者 朱小娟 葛以跃 曾晓燕 焦永军 史智扬 朱凤才 崔仑标 《江苏预防医学》 CAS 2016年第5期520-523,共4页
目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7StxⅡ基因表达,并评价其对细菌生长的影响及细胞毒性。方法针对EHEC O157∶H7StxⅡ基因设计引物,构建CRISPR/Cas9表达质粒pdCas9-StxⅡ并转化EHEC O157∶H7感受态... 目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7StxⅡ基因表达,并评价其对细菌生长的影响及细胞毒性。方法针对EHEC O157∶H7StxⅡ基因设计引物,构建CRISPR/Cas9表达质粒pdCas9-StxⅡ并转化EHEC O157∶H7感受态细胞,采用RT-PCR及胶体金法检测StxⅡ基因表达情况,绘制菌株生长曲线,将菌株培养上清液接种Vero细胞观察细胞病变情况。结果测序分析显示pdCas9-StxⅡ表达质粒被成功构建;转化EHEC O157∶H7(00G097)感受态细胞后,StxⅡ基因mRNA、蛋白表达均受抑制,EHEC O157∶H7生长曲线未受影响(P值均>0.05)。pdCas9-StxⅡ-00G097菌株培养上清液对细胞的毒性效应(CPE为30%)显著低于对照菌株00G097和pdCas9-00G097(CPE均>80%)。结论成功构建的pdCas9-StxⅡ表达质粒能特异抑制EHEC O157∶H7StxⅡ基因表达、降低细胞毒性,为进一步研究志贺毒素StxⅡ在EHEC O157∶H7致病机理和基因工程减毒活菌苗奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术 EHEC0157:H7菌株 志贺毒素
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状 被引量:3
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作者 徐瑞平 周雁 边银丙 《食用菌学报》 CSCD 北大核心 2019年第2期119-127,共9页
大型真菌与人类生活密切相关,但大部分大型真菌缺乏高效的遗传操作系统,极大地影响了功能基因功能分析及遗传改良研究。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅速,已经成为生命科学研究领域不可或缺的技术之一。笔者概述了CRISPR/Cas系统... 大型真菌与人类生活密切相关,但大部分大型真菌缺乏高效的遗传操作系统,极大地影响了功能基因功能分析及遗传改良研究。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅速,已经成为生命科学研究领域不可或缺的技术之一。笔者概述了CRISPR/Cas系统的结构类型及CRISPR/Cas9系统作用机理,介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状,并针对Cas9和sgRNA的表达、遗传转化策略、靶位点选择等影响编辑效率的关键问题进行了分析讨论,旨在为该技术在大型真菌研究中的应用提供参考。 展开更多
关键词 食用菌 药用菌 CRISPR/Cas结构类型 CRISPR/Cas9系统作用机理 CRISPR/Cas9基因编辑技术应用现状
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进展 被引量:2
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作者 郭华荣 陶奕文 《中国海洋大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期105-112,119,共9页
CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种由gRNA(guide RNA)引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术,已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降,其操作简便快速,成本低,已... CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种由gRNA(guide RNA)引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术,已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降,其操作简便快速,成本低,已成为人们探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因以及改良经济物种种质性状的重要工具。目前,该技术已经在少数几种水生甲壳动物中得到成功应用,但是由于显微注射技术在应用上的局限性,该技术在许多重要海水养殖经济物种如对虾中的应用受到限制,导致其基因编辑效率低下,难以广泛开展。本文对CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进行了综述和展望,为今后海水养殖虾蟹类的基因功能研究以及遗传育种研究提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术 水生甲壳动物 应用 显微注射 基因编辑效率
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在精神分裂症研究和治疗中的应用前景综述 被引量:1
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作者 刘艳艳 赵鹏 《医学理论与实践》 2017年第14期2054-2055,2051,共3页
精神分裂症是多发于青壮年的精神障碍性疾病之一,至今病因未明。遗传学研究结果显示遗传因素在精神分裂症发病过程中起着重要作用,它是一种具有遗传性的脑基因异常表达疾病。近年来大量的和分裂症有关的基因被鉴定和标记,治疗上依赖于... 精神分裂症是多发于青壮年的精神障碍性疾病之一,至今病因未明。遗传学研究结果显示遗传因素在精神分裂症发病过程中起着重要作用,它是一种具有遗传性的脑基因异常表达疾病。近年来大量的和分裂症有关的基因被鉴定和标记,治疗上依赖于新型的基因编辑工具进行基因的再编辑,从而治疗精神分裂症。本文综述了CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用。 展开更多
关键词 精神分裂症 MIRNA lncRNAs CRISPR/Cas9基因编辑技术
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利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除H9c2细胞Tudor-SN基因对细胞周期的阻滞及增殖的抑制 被引量:2
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作者 甘世虎 崔晓腾 +6 位作者 马锦征 房丽娇 刘明霞 任媛媛 曹晓娜 杨洁 苏超 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期754-759,共6页
基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因... 基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN基因第2个外显子的上下游sgRNA(single-guided RNA),构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8(cell counting kit 8)实验进行细胞周期和增殖的检测。Western印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除(KO)细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2野生型(WT)细胞的54.28%±0.21%升高到KO细胞的61.96%±0.40%(*P<0.05)。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6天的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19(*P<0.05)。本实验成功构建了H9c2细胞Tudor-SN基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。 展开更多
关键词 CRISPR-Cas9基因编辑技术 基因敲除 H9C2细胞 Tudor-SN基因 细胞周期阻滞与增殖
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用 被引量:3
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作者 王韶嵘(综述) 高兴春 +2 位作者 陈芳妮 乔文伟 米亚静(审校) 《实用癌症杂志》 2019年第7期1216-1218,共3页
恶性肿瘤严重威胁着我们的健康,根据国家癌症中心发布的全国癌症统计数据显示,2014年我国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例(男性211.4万例,女性169.0万例),2015年这一数字达到400万。恶性肿瘤是由遗传因素、环境因素及机体免疫系统等在... 恶性肿瘤严重威胁着我们的健康,根据国家癌症中心发布的全国癌症统计数据显示,2014年我国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例(男性211.4万例,女性169.0万例),2015年这一数字达到400万。恶性肿瘤是由遗传因素、环境因素及机体免疫系统等在内的多种因素共同作用下所引发的,其发病机制复杂,目前还不能完全阐明其具体机制。此外,恶性肿瘤的治疗主要依赖于放、化疗及手术治疗,但对于放、化疗均不耐受或已经处于晚期、失去手术机会的患者仍然没有一种有效且具有特异性的治疗方法,这些导致恶性肿瘤患者的治愈率不高且预后极差。CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅猛,具有广泛的应用前景,研究人员开创性地将其应用到肿瘤的研究中,探索复杂的肿瘤表型与基因功能间的关系,为肿瘤的研究及治疗提供了新的技术。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术 恶性肿瘤 基因治疗
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CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在动物细胞系构建中的应用 被引量:1
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作者 葛玉凤 安芳兰 +2 位作者 刘学荣 崔治亮 田波 《安徽农业科学》 CAS 2018年第35期9-10,13,共3页
CRISPR/Cas9[Clustered regular interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9]系统是广泛存在于细菌和古生菌中可降解入侵病毒和噬菌体DNA的一种基因定点编辑技术,由于其具有快速、精准、高效,易于设计... CRISPR/Cas9[Clustered regular interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9]系统是广泛存在于细菌和古生菌中可降解入侵病毒和噬菌体DNA的一种基因定点编辑技术,由于其具有快速、精准、高效,易于设计,且特异性高等优势,得到了广泛的应用。概述了CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展历程,并介绍其结构和编辑原理、在动物细胞系构建中的应用及展望,以便为更合理地应用和改进该技术提供系统的文献参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术 动物细胞系 构建
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基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的茶叶育种研究 被引量:2
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作者 陈润仪 《福建茶叶》 2020年第12期9-10,共2页
为解决传统茶叶育种成活率低的问题,基于CRISPR-Cas9基因编辑技术设计茶叶育种方法。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术,敲除茶叶育种致死基因;将sgRNA:pcoCas9茶叶育种优质基因导入茶叶树苗,敲入茶叶育种优质基因;利用非末端同源连接,实现... 为解决传统茶叶育种成活率低的问题,基于CRISPR-Cas9基因编辑技术设计茶叶育种方法。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术,敲除茶叶育种致死基因;将sgRNA:pcoCas9茶叶育种优质基因导入茶叶树苗,敲入茶叶育种优质基因;利用非末端同源连接,实现茶叶育种。设计实例分析,结果表明,设计方法茶叶育种成活率明显高于对照组,能够解决传统茶叶育种成活率低的问题。 展开更多
关键词 CRISPR-Cas9基因编辑技术 茶叶育种 成活率 茶叶树苗
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CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤治疗方面的研究进展 被引量:2
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作者 程得洛 《系统医学》 2020年第20期195-198,共4页
当前肿瘤疾病依然是威胁人们健康、生活质量的一个重要因素,探寻有效的干预手段来缓解肿瘤疾病发展甚至是治愈肿瘤是临床的重要课题,准确的诊断手段、对病情发展与干预程度的评估是控制病情的前提,随着对基因编辑技术了解逐渐深入,近年... 当前肿瘤疾病依然是威胁人们健康、生活质量的一个重要因素,探寻有效的干预手段来缓解肿瘤疾病发展甚至是治愈肿瘤是临床的重要课题,准确的诊断手段、对病情发展与干预程度的评估是控制病情的前提,随着对基因编辑技术了解逐渐深入,近年来尝试将其应用于治疗肿瘤并取得了一定的成效,其中规律成簇间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白核酸酶9(Regular cluster interval short palindrome repeats/CRISPR-related protein nuclease 9,CRISPR/Cas9)是相对新型的基因编辑手段,通过该技术不但能够准确完成RNA导向,同时还可实现对于DNA的识别、编辑,这种手段让基因编辑技术在高效、安全等方面得到厚实基础,随着该技术的深入已经实现在碱基水平基础上完成定点修饰基因的操作,为该基因编辑技术治疗肿瘤提供可靠的科学依据。CRISPR/Cas9基因编辑技术近年来被应用于治疗肿瘤,该文就对该技术的分子机制以及对于肿瘤疾病的治疗研究相关进展情况作出综述,为以后临床应用该技术治疗肿瘤疾病提供可参考数据。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术 肿瘤 基因治疗 研究进展
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关于《CRISPR/Cas9基因编辑技术在链霉菌天然产物挖掘中的应用》的撤稿声明
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作者 《沈阳药科大学学报》编辑部 《沈阳药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期480-480,共1页
本刊接到举报,称彭飞等发表于我刊2020年第37卷第4期的论文《CRISPR/Cas9基因编辑技术在链霉菌天然产物挖掘中的应用》涉嫌剽窃、抄袭,经编辑部认真调查核实,该文剽窃、抄袭行为属实,情节严重,特郑重声明:1.撤销我刊2020年第37卷第4期... 本刊接到举报,称彭飞等发表于我刊2020年第37卷第4期的论文《CRISPR/Cas9基因编辑技术在链霉菌天然产物挖掘中的应用》涉嫌剽窃、抄袭,经编辑部认真调查核实,该文剽窃、抄袭行为属实,情节严重,特郑重声明:1.撤销我刊2020年第37卷第4期刊登的《CRISPR/CaS9基因编辑技术在链霉菌天然产物挖掘中的应用》论文。 展开更多
关键词 基因编辑技术 CRISPR/Cas9 《CRISPR/Cas9基因编辑技术在链霉菌天然产物挖掘中的应用》 链霉菌 天然产物
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基于CRISPR/Cas9基因编辑技术生成靶向识别Her2的B细胞免疫治疗研究
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作者 罗保红 詹钦茹 李淑华 《热带医学杂志》 CAS 2023年第9期1212-1217,1342,共7页
目的利用规律成簇的间隔排列的短回文重复序列及其核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建靶向识别Her2的B细胞,探究基因编辑B细胞的抗肿瘤免疫治疗作用。方法设计针对B细胞抗原受体(BCR)的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体上,经重组T7... 目的利用规律成簇的间隔排列的短回文重复序列及其核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建靶向识别Her2的B细胞,探究基因编辑B细胞的抗肿瘤免疫治疗作用。方法设计针对B细胞抗原受体(BCR)的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体上,经重组T7核酸内切酶I(T7E1)酶切实验验证sgRNA的切割效率。通过分子克隆技术从曲妥珠单抗基因中调取scFv序列并和同源臂连接在一起,构建到cppt-IRES-GFP慢病毒载体中作为同源重组模板。分别将Cas9/sgRNA表达质粒和同源模板质粒与BaEVTR包膜质粒、psPAX2-D64V骨架质粒包装成整合酶缺陷的慢病毒(IDLV),用2种慢病毒同时感染人原代B细胞进行基因编辑。将基因编辑的B细胞与Her2阳性肿瘤细胞SKBR-3共培养,通过流式检测B细胞的活化和增殖。用293T-CD40L-sBAFF饲养细胞扩增基因编辑的B细胞。从临床生物样本库获取Her2阳性乳腺癌标本构建患者来源的肿瘤类器官模型,评估基因编辑B细胞浸润、清除肿瘤的能力。结果选择IGHD作为打靶位点、切割率最高的sgRNA(约为52%)作为最终的打靶序列。2种IDLV同时感染B细胞后,scFv整合效率明显提高,达到25%,差异有统计学意义(t=6.357,P<0.001)。对基因编辑的B细胞进行基因组PCR的结果显示,scFv基因定点敲入到了靶位点。流式检测基因编辑的B细胞能靶向识别SKBR-3,从而活化并增殖。靶向识别Her2的B细胞与293T-CD40L-sBAFF饲养细胞共培养能迅速大量扩增。Biotek活细胞实时荧光成像系统观测到靶向识别Her2的B细胞浸润、清除肿瘤类器官的能力显著增强。结论本研究成功获得了大量靶向识别Her2的B细胞,在肿瘤类器官模型中靶向识别Her2的B细胞能有效浸润并清除肿瘤。 展开更多
关键词 细胞免疫治疗 CRISPR/Cas9基因编辑技术 B细胞 Her2
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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制EV71复制 被引量:3
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作者 吴涛 朱小娟 +7 位作者 樊欢 葛以跃 陈银 郭喜玲 赵康辰 史智扬 朱凤才 崔仑标 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期859-864,共6页
目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对肠道病毒71型(EV71)的特定基因进行编辑,评价其抑制EV71复制的效应。方法针对EV71的VP4区设计CRISPR/Cas9表达质粒pCas-Guide-GFP-G1及含PAM序列的DNA片段并转染Vero细胞株。采用噻唑蓝( MTT)... 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对肠道病毒71型(EV71)的特定基因进行编辑,评价其抑制EV71复制的效应。方法针对EV71的VP4区设计CRISPR/Cas9表达质粒pCas-Guide-GFP-G1及含PAM序列的DNA片段并转染Vero细胞株。采用噻唑蓝( MTT)法测定细胞毒性,转染后接种病毒观察细胞病变作用( CPE),荧光定量RT-PCR法检测EV71含量,免疫共沉淀结合荧光定量RT-PCR法测定 Cas9-gRNA 在细胞内与 EV71 RNA 特异性结合的能力。结果成功构建pCas-Guide-GFP-G1表达质粒;转染细胞后未见明显细胞毒性效应;细胞转染后接种病毒发现pCas-Guide-GFP-G1+PAM1组细胞病变明显少于其他对照组;培养上清中 EV71含量较对照组降低了40.4%(P=0.056),细胞中 EV71含量较对照组降低了52.8%(P=0.014);pCas-Guide-GFP-G1+PAM1组在细胞内与 EV71 RNA 特异性结合能力最高。结论针对 EV71的 VP4基因设计的CRISPR/Cas9表达质粒在特定PAM存在下能通过对EV71基因组的剪切实现抑制EV71病毒复制的作用,可以为EV71治疗提供新的途径。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术 肠道病毒71型 病毒复制 抑制
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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制HBV复制 被引量:1
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作者 吴涛 朱小娟 +6 位作者 崔仑标 樊欢 陈银 郭喜玲 赵康辰 史智扬 朱凤才 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期600-605,共6页
目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对乙型肝炎病毒( HBV)的特定基因进行编辑,评价其抑制HBV复制的效应。方法针对HBV的S 基因设计2套CRISPR/Cas9表达质粒并转染HepG2-N10细胞株。采用噻唑蓝( MTT)法测定细胞毒性、化学发光法检测H... 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对乙型肝炎病毒( HBV)的特定基因进行编辑,评价其抑制HBV复制的效应。方法针对HBV的S 基因设计2套CRISPR/Cas9表达质粒并转染HepG2-N10细胞株。采用噻唑蓝( MTT)法测定细胞毒性、化学发光法检测HBsAg、荧光定量RT-PCR( qRT-PCR)法检测病毒mRNA表达水平,荧光定量PCR( qRT-PCR)法检测HBV DNA含量,高通量测序分析HBV基因组编辑情况。结果未见明显细胞毒性效应;2套针对HBV的CRISPR/Cas9表达质粒组培养基中HBsAg含量较对照组降低了24.2%(P=0.031)和16.9%(P〉0.05),细胞中HBsAg含量分别降低了16.4%(P〉0.05)和32.1%(P〉0.05);S、C、X基因mRNA基因表达呈现不同程度降低;培养上清中HBV DNA含量较对照组降低了23%(P〉0.05)和35%(P=0.047),细胞中HBV DNA含量降低了7.2%(P〉0.05)和18%(P〉0.05);高通量测序提示HBV基因组出现不同类型的插入/缺失突变。结论针对HBV的S 基因设计的2套CRISPR/Cas9表达质粒能通过对HBV基因组的编辑实现抑制HBV基因表达及病毒复制作用,可能为HBV治疗提供新的途径。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术 乙型肝炎病毒 抑制
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基于293T-Cas9细胞株构建ICP34.5基因敲除的oHSV-1/Ecfp病毒
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作者 蒋明正 万阳 +7 位作者 周意川 蒲诗琪 卢琳均 李嘉琪 张雨馨 邱莉芸 杨平 李敏惠 《成都医学院学报》 CAS 2024年第4期573-577,共5页
目的构建稳定表达Cas9蛋白的工具细胞,并利用短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)编辑技术改造1型单纯疱疹病毒(HSV-1),获得ICP34.5基因敲除的oHSV-1/Ecfp重组病毒。方法利用慢病毒包装体系,将包装Cas9表达质粒的病毒感染HEK293T细胞... 目的构建稳定表达Cas9蛋白的工具细胞,并利用短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)编辑技术改造1型单纯疱疹病毒(HSV-1),获得ICP34.5基因敲除的oHSV-1/Ecfp重组病毒。方法利用慢病毒包装体系,将包装Cas9表达质粒的病毒感染HEK293T细胞,然后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞株,通过聚合酶链式反应(PCR)及蛋白质免疫印迹技术检测Cas9基因及蛋白表达情况;利用分子克隆技术构建HSV-1病毒ICP34.5基因敲除的基因编辑质粒(pU6-Ecfp);pU6-Ecfp转染293T-Cas9细胞后感染野生型HSV-1病毒,在胞内通过CRISPR/Cas9技术敲除HSV-1病毒中ICP34.5基因,再利用增强型青色荧光(Ecfp)示踪及极限稀释法进行病毒富集纯化,通过PCR法进行oHSV-1/Ecfp病毒鉴定。结果PCR扩增、核酸电泳及蛋白质免疫印迹技术结果显示,细胞株293T-Cas9高转录Cas9基因及高表达Cas9蛋白;通过PCR鉴定及荧光示踪结果显示,基因编辑质粒pU6-Ecfp构建成功;Ecfp荧光示踪、PCR扩增及核酸电泳结果显示,Ecfp成功插入ICP34.5基因敲除位点,获得oHSV-1/Ecfp重组病毒。结论稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞可作为CRISPR/Cas9基因编辑的工具细胞,构建的HSV-1/Ecfp病毒实现了ICP34.5基因敲除及Ecfp示踪蛋白的敲入。 展开更多
关键词 短回文重复序列/相关蛋白9基因编辑技术 稳定表达 基因敲除 单纯疱疹病毒
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利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性 被引量:8
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作者 周天顺 余东 +4 位作者 刘玲 欧阳宁 袁贵龙 段美娟 袁定阳 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期11-18,共8页
【目的】为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。【方法】以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。【结果】AFP1靶点1和靶点2的编... 【目的】为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。【方法】以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。【结果】AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67%和75.00%。所有突变株系中,突变类型仅有插入和缺失突变,90%突变株系的突变长度为小片段突变(<5 bp)。获得了6种无转基因成分的afp1纯合突变体。正常条件下,afp1突变体株高和结实率降低,有效分蘖增加,穗长显著升高,单株产量在-4.06%和11.75%之间变化。和野生型相比,afp1突变体的ABA敏感性和叶片水分散失率降低,耐干旱、热和渗透胁迫能力提高。【结论】编辑AFP1基因可提高水稻多种非生物胁迫抗性。 展开更多
关键词 水稻 CRISPR/Cas9基因编辑技术 AFP1 耐逆性
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用 被引量:7
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作者 孟泽松 王飞飞 +2 位作者 王光林 席金川 王贵英 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1395-1401,共7页
规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸酶9(CRISPRassociated nuclease 9,Cas 9)基因编辑技术是新涌现的一种基因编辑技术,它能精准完成RNA导向的DNA识别及编辑... 规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸酶9(CRISPRassociated nuclease 9,Cas 9)基因编辑技术是新涌现的一种基因编辑技术,它能精准完成RNA导向的DNA识别及编辑,为构建更高效的基因编辑技术提供了可能,目前科研人员已经可以实现在碱基水平对基因进行定点修饰。CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛应用于肿瘤研究中。本文对CRISPR/Cas 9基因编辑技术在基因编辑中的分子机制及其在临床治疗和肿瘤研究中应用的研究进展进行综述。 展开更多
关键词 肿瘤 基因治疗 CRISPR/Cas9基因编辑技术
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通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑SSSⅡb基因改良稻米品质 被引量:3
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作者 蔡梦颖 张平 +7 位作者 宋炜涵 余江峰 郝栖贤 王平 刘世家 王益华 江玲 万建民 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期18-26,共9页
[目的]本文旨在利用基因编辑技术,降低水稻直链淀粉含量,改善稻米食味品质特性,以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料。[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,下调水稻品种‘宁粳4号’淀粉合成基因(SSSⅡb)的表达,对转基因家系进行目标... [目的]本文旨在利用基因编辑技术,降低水稻直链淀粉含量,改善稻米食味品质特性,以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料。[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,下调水稻品种‘宁粳4号’淀粉合成基因(SSSⅡb)的表达,对转基因家系进行目标基因的分子鉴定和主要农艺性状、生理生化指标的测定,选出目标育种材料。[结果]对淀粉合酶基因SSSⅡb进行多靶点编辑,得到3个目标基因敲除的转基因家系,分别为SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系。与‘宁粳4号’相比,SSS2-Q家系直链淀粉含量显著下降,支链淀粉的中等链长减少,胶稠度、热浆黏度和冷浆黏度等指标均优于‘宁粳4号’,品质指标达到预期目标;但每穗实粒数和结实率降低,粒长增加。而在SSS2-Z与SSS2-H家系中,品质指标没有实现预期目标。RT-qPCR分析发现,SSS2-Q家系中SSSⅡb基因表达下调,其他淀粉合成相关基因表达也发生变化。[结论]采用CRISPR/Cas9技术,靶向编辑‘宁粳4号’中SSSⅡb基因,降低SSS2-Q家系直链淀粉含量,品质指标得到改善,为优质食味转基因水稻新品种培育提供新种质。 展开更多
关键词 水稻 直链淀粉 CRISPR/Cas9基因编辑技术 淀粉合酶
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CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤治疗中的应用 被引量:1
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作者 杨业环 杨成玮 +1 位作者 谭小庆 高兴春 《国际肿瘤学杂志》 CAS 2018年第9期556-560,共5页
CRISPR/Cas9基因编辑系统是在古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制基础上人工改造而成的一种新型基因编辑技术。由于其高效率和准确性,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经广泛应用于肿瘤治疗的研究中,如靶向敲除致癌基因、修复抑癌基因、打破免... CRISPR/Cas9基因编辑系统是在古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制基础上人工改造而成的一种新型基因编辑技术。由于其高效率和准确性,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经广泛应用于肿瘤治疗的研究中,如靶向敲除致癌基因、修复抑癌基因、打破免疫耐受、构建肿瘤模型等,为肿瘤基因治疗带来革命性的发展。 展开更多
关键词 肿瘤 治疗应用 CRISPR/Cas9基因编辑技术
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利用CRISPR/Cas9技术构建 MLH1 基因敲除结肠癌细胞Mc38和乳腺癌细胞4T1及其微卫星状态鉴定 被引量:1
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作者 刘名安 李辉严 +1 位作者 李建明 柳玉红 《暨南大学学报(自然科学与医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期179-190,共12页
目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定鼠源性结肠癌细胞Mc38和鼠源性乳腺癌细胞4T1,为研究微卫星不稳定肿瘤在抗肿瘤免疫治疗过程中的作用机制提供细胞模型。方法:设计2条特异性靶向MLH1基因的SgRNA序列,构... 目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定鼠源性结肠癌细胞Mc38和鼠源性乳腺癌细胞4T1,为研究微卫星不稳定肿瘤在抗肿瘤免疫治疗过程中的作用机制提供细胞模型。方法:设计2条特异性靶向MLH1基因的SgRNA序列,构建lentiCRISPRv2-SgRNA重组质粒载体,经PCR、测序鉴定;将lentiCRISPRv2-SgRNA重组质粒载体分别和慢病毒包装骨架质粒pMD2.G、psPAX2共转染293T细胞构建lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒载体;利用lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒载体分别感染Mc38、4T1细胞,经嘌呤霉素和96孔板流式分选筛选出阳性单克隆细胞后PCR、Western Blot和测序鉴定;MLH1-/-Mc38细胞、MLH1-/-4T1细胞连续培养约70 d,经荧光PCR-毛细管电泳进行微卫星状态检测,筛选MLH1基因敲除的微卫星不稳定Mc38、4T1细胞。结果:测序结果表明成功构建lentiCRISPRv2-SgRNA重组质粒载体;PCR、Western Blot和测序结果表明成功构建MLH1-/-Mc38细胞、MLH1-/-4T1细胞;荧光PCR-毛细管电泳结果表明成功构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定Mc38、4T1细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定鼠源性结肠癌细胞Mc38和鼠源性乳腺癌细胞4T1,为后续深入研究微卫星不稳定肿瘤在抗肿瘤免疫治疗过程中的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术 MLH1 微卫星不稳定肿瘤 免疫治疗
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