微生物转化植物甾醇产9-羟基-雄烯二酮无油工艺研究

9-羟基-雄烯二酮(9a-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,能够合成多种皮质类甾体激素药物。本文以公司保藏的分枝杆菌Mycobacterium sp.DR01为出发菌株,通过紫外和亚硝基胍复合诱变,筛选得到一株突变菌株Mycobacterium sp.DR11,然后以植物甾醇为底物,以9a-OH-AD产量为衡量指标,通过对培养基、转化条件等参数进行优化,以及15L发酵罐小试和100L发酵罐中试放大试验,实现了20t发酵罐在植物甾醇投料量6%情况下转化96h,底物转化率达95%以上的无油化工业生产水平。

响应面法优化植物甾醇转化制备9-羟基-雄烯二酮

对获得的一株原生质体诱变分枝杆菌MS23转化制备9-羟基-雄烯二酮(9-OH-AD)条件进行优化。在单因素试验基础上,采用Box-Behnken方法进行试验设计,利用Design Expert 8.0.6软件,以9-OH-AD积累量为响应值对结果进行二次回归分析,得到的转化制备9-OH-AD最佳工艺条件分别为:玉米浆32.88 g/L、硝酸钠4.83 g/L、磷酸氢二铵0.68 g/L、pH 8.73。此最优条件下9-OH-AD积累量预测为55.53 mg/L,验证值为56.68 mg/L,与预测值的相对误差为2.07%。

C1,2位脱氢酶抑制剂对9-羟基雄烯二酮制备的影响

通过在发酵培养基中添加C1,2位脱氢酶抑制剂,研究抑制剂对分枝杆菌MS23转化植物甾醇制备9-羟基-雄烯二酮(9-OH-AD)的影响。研究表明:宝丹酮十一烯酸酯为相对效果最好的抑制剂,其最适添加时间及浓度分别为72 h、15 mmol·L^-1。在此条件下添加宝丹酮十一烯酸酯,9-OH-AD积累量可达到170.47 mg·L^-1,比对照组的46.07 mg·L^-1提高了2.7倍。此外,通过对C1,2位脱氢酶活性进行分析,进一步验证抑制剂宝丹酮十一烯酸酯对C1,2位脱氢酶存在抑制作用。最后,在分枝杆菌MS23的5 L发酵罐中添加宝丹酮十一烯酸酯,9-OH-AD于132 h后的浓度可达到138.50 mg·L^-1。

基于辅酶调控产9α-OH-AD工程菌株构建及其发酵工艺优化

利用偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)MFT降解植物甾醇生产9α-羟基-雄烯二酮(9α-OH-AD)过程中,存在丙酰辅酶A过量积累及辅因子不平衡等问题,影响菌株的转化效率。通过表达scpC降低胞内丙酰辅酶A含量,并通过串联表达ndh解决植物甾醇侧链降解过程中胞内辅因子I不平衡的问题,在此基础上表达AarC将琥珀酰辅酶A和乙酸盐转化为琥珀酸盐和乙酰辅酶A,增强三羟酸(TCA)循环。构建的重组工程菌株MFT-scpC-AarC-ndh经初步优化发酵后,9α-OH-AD产率达到89.56%,比原始菌株转化率提高了37.86%。本研究为9α-OH-AD的工业化生产提供了理论基础和技术支持,也为其他植物甾醇转化工程菌株的构建提供新策略。

16α-甲基甾体化合物的合成

分别以4,9-二烯雄甾-3,17-二酮(4-AD)、9α-羟基-4-雄烯二酮(9α-OH-4-AD)为原料,通过保护反应、亲核取代反应和水解反应,合成了16α-甲基甾体化合物,并利用核磁波谱和红外光谱对其结构进行表征。采用的方法步骤短,收率高,基本避免了构型异构体的产生,副反应少,降低了成本。

氢化可的松关键中间体的合成

介绍了一种以9-羟基-4-雄烯二酮作为起始原料,经过消除、氰醇化、醚化、重排、置换反应制备17α-羟基孕甾-4,9(11)-二烯-3,20-二酮-21-醋酸酯的方法。主要优化了合成路线中消除、醚化和重排的反应条件,优化后的总收率可达68.2%。该方法操作简单,产物结构经1H NMR、13C NMR及MS(ESI)确证。