96孔板药敏试验自动判读系统设计

目的探讨96孔板药敏试验自动判读系统的设计与开发。方法选用数字相机对96孔板进行图像采集,运用机器视觉技术进行图像识别,从而得到药敏试验判读结果。采用图像拼接技术,将96孔板分为8个区域,运用二维运动平台进行多次采集,既提高了图像的分辨率,也克服了图像畸变带来的判读误差。结果制作了96孔板药敏试验自动判读系统,判读准确率达到100%,判读用时为人工的1/4~1/3h,且实现判读结果自动统计存储。结论自动判读系统能提高96孔板药敏试验的精度和效率。

自动固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中15种防晒剂和防腐剂

本文建立了同时快速测定人尿液中15种防晒剂和防腐剂的高通量自动固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱测定方法(automatic SPE-UPLC-MS/MS).人尿液经β-葡萄糖醛酸酶过夜酶解后,以Waters HLB 96-well Plate(30 mg,30μm)为基础,使用全自动固相萃取装置进行前处理,经25%乙腈溶液淋洗,甲醇-乙腈溶液(V:V=1:1)洗脱,氮吹至近干,20%乙腈溶液复溶后,采用Waters Acquity BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)、二元梯度洗脱系统(流动相A为水,流动相B为乙腈)进行色谱分离.质谱方法采用多反应监测(MRM)模式、电喷雾电离负离子模式和稳定同位素内标法进行数据采集和定量分析.15种分析物在相应线性范围内的线性相关系数(r)均大于0.999,3个加标水平的加标回收率为89.1%-110%,日内和日间精密度分别为0.9%-13%和3.1%-14%,样本稳定性、提取液稳定性、上样周期稳定性和反复冻融稳定性的相对标准偏差均在10%之内.将本方法应用于300名志愿者随机尿液的测定,结果显示该人群尿液的主要检出成分为4种防腐剂,分别是羟苯甲酯(MP)、羟苯乙酯(EP)、羟苯丙酯(PP)和对氯间二甲苯酚(PCMX),检出率分别为100%、92%、82%和64%,中位浓度分别为11.5、0.53、0.65、2.09 ng·mL^(-1).综上,本方法可应用于人尿液中15种防晒剂和防腐剂的快速提取、净化和定量分析,具有操作简便、灵敏度高、效率高、人员友好和绿色环保等优势,适用于大批量样品的检测应用.

96孔板法筛选抗黑曲霉性乳酸菌及抑菌机理研究

目的:筛选对黑曲霉具有良好拮抗作用的乳酸菌菌株。方法:采用96孔板法进行乳酸菌优良菌株的筛选。研究p H和温度等因素对抗菌特性的影响,利用气相测定菌株DL3无细胞上清液(CFS)中有机酸含量,研究抑菌活性物质;利用扫描电镜分析孢子细胞的完整性,研究抑菌机理。结果:从传统东北酸菜分离的乳酸菌中筛选对黑曲霉具有较强抑制作用的植物乳杆菌DL3,其抑菌率为92.28%。在p H2.5~6.5对黑曲霉具有抑菌活性,并具有良好的热稳定性,121℃处理30 min后抑菌率仅降低5.71%。经气相色谱分析表明菌株DL3 CFS中乳酸、乙酸、丙酸和苯乳酸含量分别为5.743、1.635、0.033、0.085μg/m L,乳酸和乙酸对黑曲霉的抑菌率分别为91.69%和92.04%,丙酸和苯乳酸均无抑菌作用,初步判断菌株DL3的抑菌活性物质为有机酸类。扫描电镜观察表明菌株DL3 CFS破坏了黑曲霉孢子的完整性,导致细胞膜溶解,胞内物质外泄。结论:菌株DL3 CFS中对黑曲霉的抑菌活性主要来自于乙酸和乳酸,可作为米面制品的乳酸菌生物防霉剂的出发菌株。

利用96孔板建立除草剂微量活体筛选方法初探

以马唐、稗草、反枝苋3种杂草为指示植物,采用96孔板建立了化合物除草活性微量活体筛选方法.从6种培养基中筛选出最适合3种指示杂草生长的Ⅰ号培养基,以传统盆栽法为对照,进行了96孔板苗前处理微量活体筛选方法(以下简称96孔板法)的研究.结果表明:96孔板法以指示杂草的株高受抑制情况作为评价指标较为合适;3种供试除草剂采用96孔板法对3种指示杂草所表现出的杀草活性要高于盆栽法;乙氧氟草醚、二甲戊灵、氟乐灵盆栽法的EC50和EC90值分别是96孔板法的1.44～21.47倍和1.47～32.84倍;采用96孔板法,乙氧氟草醚对马唐和反枝苋、二甲戊灵对稗草的活性最高,EC50值分别为0.79、0.73和0.45μg/mL,EC90值也分别只有3.13、1.72和1.36μg/mL.96孔板法达到了微量、敏感、节省时间和空间的要求,是发现先导化合物除草活性较适宜的微量活体筛选方法.

96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的研究

考察了刺糖多孢菌在96孔板固体培养基和液体培养基中的生长情况,建立了96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的方法。结果表明:96孔板三明治盖能同时满足过滤杂菌和刺糖多孢菌生长耗氧所需,刺糖多孢菌在96孔板固体培养基中的生长情况与传统斜面培养相当,种子培养最适种龄为60h,每孔发酵培养基装液量为0.4mL。与传统摇瓶发酵筛选平台相比,该方法能显著提高多杀菌素高产菌株的筛选效率。

在线超声提取96-孔盘技术高通量快速测定全叶马兰中果聚糖成分

采用在线动态超声提取装置对全叶马兰果聚糖成分进行提取,用效应面方法优化了在线提取条件。提取溶剂为纯水,待测样品为5 mg,提取条件为超声功率是496 W,溶剂流速0.63 mL/min,溶剂体积4.69mL;用96-孔盘联合酚硫酸程序对果聚糖进行高通量快速检测,果聚糖的加标回收率为98.3%～105.7%,相对标准偏差为2.9%～4.1%,全叶马兰果聚糖含量为17.60%。15 min内可分析24个样品。试剂用量较常规比色分析减少了95%。本方法快速、准确,特别适合天然植物资源生态学研究中数以百计的大样本统计调查。

96孔板-PCR排除法筛选猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因

为了从猪蛔虫雌虫cDNA文库中筛选出猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因,本研究根据猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因的EST序列为模板设计引物,采用96孔板-PCR排除法对猪蛔虫雌虫cDNA文库进行筛选,并筛选出阳性克隆F993-G10-A10。测序结果表明,该基因序列长621bp,有完整的3'端。经BLAST分析,其推导的氨基酸序列与秀丽隐杆线虫(C.elegans)的卵黄蛋白原基因(Vit1、Vit2、Vit3、Vit4和Vit5)的氨基酸序列的一致性分别为35%、35%、34%、34%和35%,核苷酸序列相似性分别为55%、57%、54%、54%和53%。该阳性克隆的获得为该基因的深入研究奠定了基础。同时也证明了96孔-PCR排除法是一种高效、简便、低成本的筛选文库方法。

新型低成本高效节能96孔洗板机的设计与实现

目的:研制一款高效率、宽条件的洗板机,解决当前洗板机常见的效率低、注液压力不均匀、存在交叉污染、系统稳定性不高等问题。方法:新型洗板机改用96针的分配头,替换原有的12针或8针分配头,并且支持双板清洗方式,缩短洗板时间,提高效率;采用压力平衡系统,调节吸液瓶与管路压力,使注液均匀,减少溢液、溅液现象,防止瓶内压力增大冲破液路连接处;采用防溢液装置实现电液分离。结果:实践表明,该洗板机效率分别为12针、8针洗板机的8倍、12倍;在临床测试与压力测试中,能有效抑制交叉污染,及时吸走残液,防止电气部分进水短路。结论:该洗板机可有效改善当前洗板机存在的常见问题,提高孔板清洗速度和质量。

第三代流式细胞分选仪及96孔板分选单个细胞的方法及参数优化

目的：用第三代流式细胞分选仪比较不同直径喷嘴分选的单细胞的得率及细胞活性,进一步完善单细胞微孔板分选的参数设置及条件优化。方法：用FACSAriaⅢ流式细胞分选仪及96孔板对Raji细胞、A549、DT 40、RAW 264.7细胞系进行单细胞分选,分别采用70μm、100μm和130μm喷嘴分选,比较分选后单细胞得率及克隆形成率。结果：在单细胞分选模式下,用3种不同直径喷嘴及96孔板分选后的单细胞得率为86.55%-93.44%,即96孔板有单细胞的孔数为84-92孔;分选后的单个细胞培养7d后,经70μm、100μm和130μm喷嘴分选的单细胞克隆孔数分别为31-52孔、49-70孔、58-78孔。结论：进行单细胞微孔板分选时,在精确调节及优化实验参数的前提下,为了保证单细胞的活性,应优先选择100μm或130μm喷嘴。

捷安肽素高产突变株96孔板筛选方法的建立

建立了一种快速灵敏地筛选出捷安肽素(JAA)高产突变株的方法。主要利用96多孔板固体培养菌体,用50%乙醇为最佳浸提液浸提4h,滤纸片法检测JAA生物活性的点样量为100μL,筛选出5株高产突变株,经摇瓶复筛选出2株高产突变株,经一剂量法检测,其抑菌圈直径较出发菌株提高了14%左右。

96孔板法用于除草剂高通量筛选的研究

分别用三角瓶法和96孔板法研究了4种除草剂(精吡氟禾草灵、精喹禾灵、氯氟吡氧乙酸、乙草胺)对小球藻的72 h生长抑制急性毒性效应,结果表明:这四种除草剂均对小球藻表现出一定的水生毒性,用两种方法测得的除草剂对小球藻毒性趋势基本一致,半抑制浓度EC50值非常接近.96孔板法用于农药高通量筛选时,与国际标准组织推荐的三角瓶法的可靠性程度基本相同.三角瓶法筛选农药时需要毫克级的量,而96孔板法只需要微克级的量即可满足筛选的需要.

96孔板高通量选育嗜线虫致病杆菌高产帕克素菌株

帕克素(pekingmycin)是嗜线虫致病杆菌北京变种Xenorhabdus nematophilus var.pekinense CB6菌株代谢产生的广谱抗生素。研究证明帕克素对马铃薯晚疫病和辣椒疫病均具有较好的田间控制效果。为了进一步提高帕克素产量,为实现产业化奠定基础,本文首次用96孔板高通量筛选技术进行了帕克素高产菌株的筛选。将原始菌株CB6用紫外、微波和亚硝基胍诱变后在96孔板固体培养基上培养72 h,35%甲醇浸提24 h,根据浸提液OD312紫外吸收值和抑菌圈直径筛选出10株活性较高的正突变株。但由于存在遗传不稳定现象,故对其中一株优良突变株90#(菌株编号为90)进行了二次累加诱变,经初筛和复筛,得到4株比出发菌株抑菌圈显著增加的突变株,较出发菌株抑菌圈直径提高了6.39%～11.94%。对其中的2株突变株进行了遗传稳定性测定,结果表明,连续培养6代后,突变株抑菌圈直径无显著变化,菌株特性能稳定遗传。

流式细胞仪MoFlo Astrios^(EQ)96孔板单细胞分选方法的条件优化

目的·优化流式细胞仪MoFlo Astrios EQ 96孔板单细胞分选方法,为单细胞技术的应用奠定基础。方法·通过对仪器精确调节及各项参数优化,采用不同孔径喷嘴、不同分选方式对32D、U937、iBMDM和293T共4种细胞进行单细胞分选,观察分选后单细胞孔数以及单细胞所形成克隆孔数。结果·在单细胞分选模式下,70、100μm喷嘴分选获得单细胞的孔数分别为83~91、87~93孔。分选后的单细胞经7~10 d培养后,70μm喷嘴分选获得的单细胞所形成克隆的孔数为36~58孔;100μm喷嘴条件下电荷式分选、"无电"直接分选获得的单细胞所形成克隆的孔数分别为53~78、69~81孔。结论·进行单细胞分选时,选择100μm喷嘴和"无电"直接分选方式可得到较好的细胞活性与较高的细胞克隆率。

利用96孔板和酿酒酵母生长圈复合筛选高产管囊酵母

野生酿酒酵母不能利用木糖作为碳源,但是可以利用乙醇作为碳源和能源。管囊酵母可以利用木糖生产乙醇。酿酒酵母可以利用管囊酵母生产的乙醇作为碳源。本研究将管囊酵母进行紫外诱变后,利用96孔板培养,选取OD值较高的孔进行酿酒酵母生长圈筛选。管囊酵母在木糖(5%)为唯一碳源的YNB培养基上生长并产生乙醇。产生的乙醇越多,指示菌酿酒酵母的生长圈相对越大。利用酿酒酵母生长圈法筛选的正变率为35.22%,筛出1株菌UV171,乙醇产量为10.7 g/L,比对照高25.9%,对菌株UV171进行稳定性实验,传至3代其产量稳定。

96孔板高通量选育产乙醇酵母

以巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris),安琪酵母(Angelyeast),酿酒酵母(Saccharo-mycescerevisiae)等4株菌为出发菌株,经过紫外诱变,96孔板高通量筛选出60株,复筛选出4株。最大乙醇产量提高到76.6g/L,糖醇转化率达到了0.488g/g。对上述4株菌进行耐乙醇性能驯化,发酵耐乙醇能力达到15%。

96孔板定位夹具及其进样装置设计

在很多自动化生物实验中,都需要用到96孔板来承载液体样本,然后进样装置吸取样本到后端组件去处理和分析。设计一种96孔板定位夹具来保证96孔试剂板安装方便并精确定位,进样装置通过高精度三维机构移动来实现96孔板每一个样本的精准吸取,并有效避免样本之间交叉污染。

测试平台在文96储气库注采井的研制与应用

随着文96储气库注采井的投产运行,优质、高效、安全地做好文96储气库注采井的动态监测工作是十分重要的。由于储气库井属高压注采井采气树选用压力等级为35MPa以上的井口装置,距地面高度达到3m以上,井口操作人员站在注采井单侧阀上活动空间狭小,而且还得举升安装拆卸几十斤重的井口防喷装置及仪器、配重组合,稍有不慎便有人员高空坠落的危险,存在较大的安全隐患,且工作效率过低,结合文96储气库监测现状,围绕储气库发展需求,研制了适用于文96储气库注采井测试的井口操作平台,应用到现场,取得了显著的效果。

2种圆形微孔板内部流场的CFD数值模拟

为改善96孔板传质率和剪切力低的情况,提出一种带挡板的96孔板模型。基于VOF模型和RNG k-ε模型结合建立了孔板内部的流体动力学模型,利用仿真软件FLUENT对其数值进行模拟。在不同转速下,对其气液交界面面积、气液比表面积、平均液膜传质系数和体积平均气液传质系数等传质相关系数和平均剪切应变率进行对比。模拟结果表明:在不同转速下,带挡板96孔板的体积平均传质系数和剪切应变率都要高于普通96孔板;并且考察了带挡板96孔板在特定转速下不同装液量对其传质性能的影响。模拟结果表明:随着装液量的增加带挡板96孔板的气液传质系数逐渐降低,得出66.56μL为最佳装液量。综上所述,带挡板96孔板有效提高了普通96孔板的传质性能,并为其提供了更好的剪切环境,为孔板的设计和优化提供了参考。

一种适用于高通量基因分型的水稻种子切片DNA制备技术

建立一种高质量、低成本的水稻种子切片DNA制备方法,用于育种群体的高通量基因分型。通过对比TPS法提取水稻叶片DNA及96孔板结合磁珠法提取切片种子DNA的纯度和浓度,进一步采用STARP(Semi-thermal asymmetric PCR)标记检测验证96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA的质量。结果表明:96孔板结合磁珠法提取水稻种子切片的DNA质量和纯度优于TPS法提取水稻叶片的DNA质量;STARP标记检测验证结果显示96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA可适用于GS3、Wx的STARP标记基因分型,其鉴定结果与测序结果一致。研究显示96孔板结合磁珠法可以从微量水稻种子切片中提出高回收率、高纯度、高完整度、无PCR抑制物的DNA用于高通量STATP法基因单倍型分析,可获得一种96孔板结合磁珠法提取DNA的高通量基因分型操作流程。

双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究

双果糖酐水解酶(difructose anhydrideⅢhydrolase,DFA-Ⅲase)能将新型功能甜味剂双果糖酐转化为益生元菊二糖,然而DFA-Ⅲase酶活性较低,为了提高DFA-Ⅲase酶法合成菊二糖的能力,该研究对来源于Arthrobacter chlorophenolicus A6的双果糖酐水解酶AcDFA-Ⅲase进行分子改造。基于已有的AcDFA-Ⅲase的晶体结构,选择酶活性口袋上方loop区和活性口袋中的14个关键位点进行定点突变,得到17种DFA-Ⅲase突变体。利用96孔板作为高通量培养容器,结合DNS法快速测定酶活性,初筛得到一个酶活性提高的突变体D380A。用HPLC法测定分离纯化出的酶活性,验证结果表明其酶活性有显著提高,酶比活性是AcDFA-Ⅲase的162.3%。同源建模分析,380位天冬氨酸突变成丙氨酸后,loop环区域疏水性增强,保证了催化中心的疏水微环境,提高了酶的催化活性。该研究建立的高通量检测方法为DFA-Ⅲase的筛选以及菊二糖的大量生产奠定了基础。