产肠毒素性大肠杆菌F41与987P菌毛蛋白的串联表达

根据GenBank中发表的E.coli F41、987P基因序列,分别设计合成一对引物。利用PCR技术,分别以大肠杆菌C83707的基因组和C83710的质粒为模板扩增F41、987P基因。通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切、连接和转化,构建了含F41-987P串联表达载体的重组菌株BL21(DE3)/pETF41-987P。经酶切、PCR鉴定和DNA序列分析,证实了构建的重组质粒pETF41-987P中含有F41-987P融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经过SDS-PAGE分析,串联表达蛋白含量在30%左右,经Western blot检测,该串联表达蛋白能被大肠杆菌F41、987P阳性血清识别。反向间接血凝试验结果,F41效价为26～28,987P效价为28～210。说明F41-987P融合蛋白具有良好的抗原性。表明构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株。

仔猪黄痢K88-K99-987p-F41多价菌毛疫苗的制备及小鼠免疫试验

为了更好地预防仔猪黄痢,选取野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K 88ad)、HN2004(K 99)、HN2005(987p)和HN2006(F41)培养后用低温磁力搅拌法提取菌毛,制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗。试验结果表明,5批多价灭活疫苗对小鼠的平均保护率达95.0%,为进一步进行本体动物试验提供了有价值的参考资料。

K_(88)、K_(99)、987P基因工程三价苗的免疫效力试验

对六个批次的K_(88)、K_(99)、987P基因工程三价苗作免疫效力测定。第一次试验,对用三个批次基因工程三价苗被动免疫(通过初乳)的仔猪,以三种强毒菌进行攻击,死亡率上均获得100%保护,黄痢腹泻发病率上获得98%保护;而对照仔猪,对三种强毒菌的攻击,发病率均达100%,死亡率分别是K_(88)为96%、K_(99)为72.7%、987P为80%,平均83.3%。第二试验的另外三个批次的基因工程三价苗的被动免疫(通过初乳)仔猪,虽然三种强毒菌的攻击剂量各增加三分之一,但保护率仍达到与第一次试验一致的结果;而对照仔猪,黄痢腹泻发病率均达100%,死亡率分别为K_(88)100%、K_(99)95%、987P91%,平均95%。

K88、K99、987P基因工程三价苗野外应用效果的初步观察

对K_(88)、K_(99)、987P基因工程三价苗野外应用效果观察是通过对几个猪场的纵向比较,邻圈间、棚舍间、猪场间横向平行比较和被动免疫仔猪的接触感染三种方式进行的。通过8个猪场的纵向比较,结果发病率减少11～46.4个百分点,平均减少25.4个百分点;死亡率减少7.6～29.1个百分点,平均减少21.4个百分点。应用基因工程三价苗后,这些场发病率控制在5％左右,死亡率控制在1％左右。横向平行比较结果,邻圈间、棚舍间免疫组发病率减少约40个百分点,死亡率减少约25个百分点。免疫场与对照场间比较,发病率分别减少54个和36个百分点,死亡率分别减少54个和28个百分点。接触感染结果,被动免疫仔猪无一头发病,也无死亡,而寄奶母猪亲生仔猪则发病率100％,死亡率98％。

猪产肠毒素大肠杆菌987P蛋白受体的鉴定

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)定植于仔猪肠道的第一步是通过987P菌毛与小肠上皮细胞表面刷状缘大分子(BBV)结合。对分离的BBV进行SDS-PAGE和Ligand blot分析表明,在32～35KDa区域内有一条带能被987P菌毛探针所识别和结合,所结合的条带经胰蛋白酶消化后,通过微内径反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离出多条主要峰带蛋白峰带,采用衬质辅助激光解吸与电离质谱法(MALDI-MS)对主要峰带进行分析,结合多肽氨基酸测序和Blast同源性比较,得到3个氨基酸基序(AETAP、ALAAAGYDVEK和LGLK),其序列与人和鼠源的组蛋白H1高度同源;来源于仔猪小肠上皮细胞BBV的H1蛋白与BBV一样都能特异性结合纯化的987P菌毛蛋白。上述结果表明,仔猪小肠上皮细胞BBV的组蛋白H1是987P菌毛蛋白的受体。

共表达ETEC 987P、K88重组乳杆菌构建及其免疫原性分析

构建表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)987P和K88蛋白的重组干酪乳杆菌,并对重组干酪乳杆菌免疫原性进行分析。通过PCR构建重组质粒pLA-987P-K88并电转化至干酪乳杆菌6105后进行表达,通过Western blot、间接免疫荧光和流式细胞术检测目的蛋白的表达情况。将重组干酪乳杆菌灌胃免疫BALB/c小鼠,三次免疫后用ELISA检测小鼠血清中IgG抗体和肠冲洗液中sIgA抗体水平,采用CCK-8检测淋巴细胞的增殖情况,用C83916(987P)株和C83902(K88)株进行攻毒保护性试验检测其保护率。结果显示,重组干酪乳杆菌成功表达987P-K88融合蛋白,小鼠免疫重组菌后血清中IgG抗体水平和肠冲洗液sIgA水平显著升高,细胞免疫水平明显增长,攻毒保护性试验结果显示,重组菌能同时对C83916(987P)株和C83902(K88)株具有良好的保护作用。

ETEC 987P、K88二价重组干酪乳酸菌的构建及免疫仔猪效果评价

为了制备产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)987P和K88的二价重组乳杆菌,并检测其免疫效果,试验根据ETEC C83916株(GenBank登录号M35257.1)987P基因序列和ETEC C83902株(GenBank登录号M29375.1)K88基因序列设计合成特异性引物,将PCR扩增的987P、K88基因连接至穿梭载体pHCE1LB-pgsA(简称pLA),热激法转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经PCR、双酶切鉴定为阳性的重组质粒电转化入干酪乳杆菌中,通过Western-blot、间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。将50头健康的初生仔猪分为试验组和对照组,试验组初生仔猪通过口服免疫重组干酪乳杆菌菌液(浓度为1×10^(9) cfu/mL),对照组口服等体积生理盐水,连用5 d,在免疫前称量体重,并于免疫前(第0天)及免疫后第5,10,15,20,25天采集血液和粪便,采用ELISA检测血清IgG抗体和粪便中sIgA抗体水平;免疫后10天试验组和对照组分别随机选取20头仔猪用ETEC C83916株和C83902株进行攻毒,计算攻毒保护率,试验结束后称量仔猪体重。结果表明:成功构建了重组菌pLA-987P-K88/L.casei,Western-blot检测显示pLA-987P-K88/L.casei在85 ku处出现明显条带,在荧光显微镜下pLA-987P-K88/L.casei可观察到明显的绿色荧光。初生仔猪免疫重组菌pLA-987P-K88/L.casei后5~25 d,IgG抗体和sIgA抗体水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。重组菌对ETEC C83916的攻毒保护率为90%,对ETEC C83902的攻毒保护率为80%。说明ETEC 987P、K88二价重组干酪乳酸菌可以有效抑制仔猪感染ETEC,大大降低新生仔猪腹泻率。

共表达K88/987p菌毛产肠毒素性大肠杆菌的分离鉴定及其卵黄抗体的制备

为制备针对一些大型养猪场产肠毒素性大肠杆菌(enterotrxigenic Escherichia coli,ETEC)分离株的特异性卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin,IgY),试验对从这些养殖场分离的ETEC分离株菌毛基因类型进行了PCR鉴定,纯化该分离株的菌毛蛋白免疫蛋鸡制备IgY,对该IgY的效价、特异性和体外抑菌效果进行了检测。结果表明,该分离株具有K88和987p两种菌毛基因,纯化后的分离株菌毛具有较强的免疫原性,经3次免疫后产生的IgY对K88和987p全菌和菌毛的效价可达到1∶64 000,分离株菌毛IgY能特异地与K88和987p反应,与K99、F41无交叉反应,5mg/mL分离株菌毛IgY在体外具有很好的抑菌效果。

一株能表达987P和F_(41)两种粘附素的猪源性大肠杆菌的研究

通过直接凝集试验、免疫荧光试验、SDS-PAGE和Western印迹,对一株猪源性大肠杆菌的粘附素进行了研究.结果表明,该菌株是一株同时表达987P和F_(41)两种粘附素抗原的猪源性大肠杆菌.

猪K_(88)、K_(99)、987P、F_(41)埃希氏大肠杆菌高密度发酵培养技术的初步探讨

采用高密度发酵和普通深层通气两种方法培养含K88、K99、987P、F41菌毛抗原的四株猪埃希氏大肠杆菌,对其培养液进行活菌数、OD值、pH值、效价的测定。实验结果表明,运用高密度发酵方法培养,各菌活菌数可达4.1×1010~4.9×1010CFU/mL,效价为211~213;运用普通深层通气方法培养,各菌活菌数为0.51×1010~0.59×1010CFU/mL,效价为24~25,可选择高密度发酵方法替代普通深层通气方法培养,用于制备猪埃希氏大肠杆菌K88、K99、987P、F41四价菌毛提纯苗。

抗大肠杆菌987P粘着素单克隆抗体及其初步应用

共研制出11株抗大肠杆菌987P 粘着素单克隆抗体,对其部分免疫学特性作了测定。这些单抗不仅效价很高,而且特异性强,对不具有987P 抗原的大肠杆菌及所试的其他肠道杆菌均无交叉反应。以 FITC 或 HRPO 标记的987P 单抗作实验室诊断,具有简易、快速、敏感和准确的优点。酶标 EPN3株单抗检测的灵敏度可达2×10~3个/ml 987P^+菌,对人工发病仔猪的粪样和小肠内容物的阳性检出比分别为4/4和2/2。EP22株荧光标记单抗对病猪小肠粘膜触片的阳性检出比为6/6。11株单抗中7株能不同程度地阻断987P^+菌对仔猪小肠上皮细胞的吸附作用。ELISA 和荧光阻抑试验表明,11株单抗是针对987P 粘着素上三种不同的抗原决定簇。EPN2株单抗的免疫胶体金定位还表明,987P 粘着素似呈螺旋状结构,且含有许多相同的抗体结合位点。这些单抗不仅可用于 ETEC 菌株的987P 柔毛鉴定,而且可用于987P 分子结构和生物学特性的研究。

产肠毒素大肠埃希菌K99-987P-F41融合蛋白在小鼠体内免疫效果的评价

目的评价产肠毒素大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99-987P-F41融合蛋白在小鼠体内的免疫效果。方法制备ETEC融合蛋白K99-987P-F41亚单位疫苗、ETEC全菌体灭活疫苗、ETEC天然菌毛K99-987P-F41混合蛋白亚单位疫苗及ETEC重组菌毛K99-987P-F41混合蛋白亚单位疫苗,分别免疫小鼠,同时以免疫PBS的小鼠作为对照。ELISA法检测小鼠血清中IgG、IL-4和IFNγ的水平及小鼠粪便和小肠冲洗液中分泌型免疫球蛋白A(secreted immunogobulin A,sIgA)的含量;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况,并进行攻毒试验。结果 ETEC融合蛋白K99-987P-F41重组亚单位疫苗组小鼠血清中的抗ETEC的特异性IgG抗体、IL-4、IFNγ、粪便和小肠冲洗液中的sIgA、小鼠脾脏B和T淋巴细胞增殖能力均显著高于PBS对照组(P<0.05);ETEC融合蛋白K99-987PF41重组亚单位疫苗对小鼠的保护率为80%,与其他3种疫苗的小鼠保护率相近,而PBS对照组为0。结论 ETEC融合蛋白K99-987P-F41可有效诱导小鼠产生较高滴度的特异性抗体,可作为ETEC重组亚单位疫苗候选蛋白。

适用于蛋鸡免疫的猪源ETEC菌毛蛋白佐剂的筛选

为筛选卵黄抗体的优良佐剂,以3株猪源致病性大肠杆菌(ETEC)菌毛蛋白为模式抗原,分别与6种佐剂制备多价菌毛蛋白疫苗,免疫海兰褐壳蛋鸡。结果显示,3次免疫后,所有试验组蛋鸡产蛋率均有不同程度下降,但SPA、ISCOMs、弗氏佐剂、蜂胶佐剂组的产蛋率下降程度较为轻微;对鸡体血清抗体和制备获得的卵黄抗体的效价检测结果均显示:SPA和ISCOMs组虽较SPB、SPC、弗氏佐剂组抗体水平略低,但持久度较好,且通过对蛋鸡外观形态和注射部位组织变化情况的观察显示,两者不会刺激鸡体热反应或炎症反应,无任何表观副作用。因此,更适合作为蛋鸡制备猪源ETEC卵黄抗体的优良佐剂。

4种方法预防仔猪黄、白痢试验效果观察

通过A、B、C、D4种方法对仔猪黄、白痢进行预防,结果表明:B、C、D3组比A组发病率分别减少51.73、61.33和64.81个百分点,死亡率分别降低8.91、14.13和18.26个百分点,差异极显著(P<0.01);B组仔猪平均断奶重高于A组10.69%,差异显著(P<0.05);C、D两组仔猪平均断奶重分别高于A组20.68%、21.24%,差异极显著(P<0.01);C、D两组的发病率均极显著地低于B组(P<0.01),C组死亡率比B组减少5.22个百分点,差异显著(P<0.05),D组死亡率比B组减少9.35个百分点,差异极显著(P<0.01);C、D两组仔猪平均断奶重高于B组9.02%、9.53%,差异均显著(P﹤0.05);D组的发病率、死亡率均显著低于C组(P﹤0.05),D组仔猪平均断奶重高于C组0.47%,但差异不显著(P﹥0.05);另外预防和治疗费用B、C、D3组分别比A组低1.04、0.71、0.64元/头,其中以B组费用最低,仅为0.09元/头。

猪产肠毒素大肠杆菌_(987)P菌毛卵黄抗体的研究

【目的】探索产肠毒素大肠杆菌(ETEC)987P菌株培养的最佳条件及987P菌毛诱发蛋鸡制备卵黄抗体(IgY)的最佳免疫程序,为IgY的工业化、规模化生产提供参考。【方法】扩大培养987P菌株,抽提层析纯化987P菌毛蛋白,然后以其为抗原免疫20周龄开产海兰蛋鸡,采用间接ELISA检测987P菌毛蛋白免疫IgY效价。【结果】987P菌株的最佳培养条件为37℃下Slanctz固体培养基培养24h;以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫20周龄开产蛋鸡,发现987P菌毛蛋白二免、三免IgY效价总体趋势基本一致,均在第3周达到峰值并维持1周,二免抗体峰值为213,三免抗体峰值是二免峰值的2倍(214),但第4周过后三免IgY效价仍保持在213,且持续时间长,一般维持2～3周。【结论】以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫蛋鸡,能获得较高效价的IgY,且适当增加免疫次数能有效提高抗体水平和延长持续时间。

大肠埃希氏菌表面菌毛黏附因子多价菌毛疫苗的研制

为了预防仔猪黄痢,选取ETEC野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K88ad)、HN2004(K99)、HN2005(987p)、HN2006(F41)培养后用低温磁力搅拌法提取到菌毛,制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗,实验室试验结果表明,5批多价灭活疫苗对小白鼠的平均保护率达95.0%,为进一步进行田间试验提供了理论依据,并将为生产上防治仔猪黄痢提供一种保护范围更加全面的生物制品。

新型流面型冷电弧装置杀菌研究

自制了流面型冷电弧杀菌装置,并研究了外加电压、气体流量、菌液流量、细菌种类和杀菌时间等参数对该装置杀菌率的影响.结果表明,杀菌率随着外加电压升高、液体流量降低以及杀菌时间增加而升高,空气自然对流的杀菌效果优于强制对流,对革兰氏阴性菌的杀菌效果优于革兰氏阳性菌.在空气自然对流、外加电压为33 kV和液体流量为80 mL/min的条件下,对E.coli987P的杀菌率达99.96%,所需时间不超过35 s;而S.aureus需经过70 s后,才能达到相同的杀菌率.冷电弧处理后的液体温升不超过3℃.通过透射电镜图发现,处理后的大肠杆菌(E.coli987P)细胞膜发生不可逆击穿,细胞内容物外流,最终导致菌体死亡.