白细胞介素12基因修饰大鼠胶质瘤9L/rIL-12细胞的建立

目的构建大鼠白细胞介素12(rIL-12)基因真核表达载体质粒,建立rIL-12基因修饰并稳定表达的大鼠胶质瘤9L/rIL-12细胞。方法用Trizol提取大鼠腹腔巨噬细胞总RNA,RT-PCR方法分别获取rp40和rp35cDNA,依次克隆入pcDNA3.1(-)/myc-HisA质粒中,以IRES连接双亚基,构建成双顺反子真核表达载体质粒pcDNA3.1/rIL-12。将构建的重组质粒转染大鼠胶质瘤9L细胞,G418筛选单克隆细胞株,ELISA法检测其培养上清rIL-12(p70)蛋白含量,同时抽提细胞RNA,RT-PCR方法检测rp40、rp35基因在9L/rIL-12细胞中的表达。结果所得rp40cDNA序列与GeneBankNM022611及AF133197、rp35cDNA序列与GeneBankNM053390及AF177031均一致,构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。质粒转染9L细胞后,获得2个rIL-12基因稳定、高效表达的9L/rIL-12单克隆细胞株,其培养上清rIL-12(p70)蛋白含量分别为139.0、162.1pg/ml,RT-PCR结果显示细胞中rIL-12基因表达呈阳性。结论成功构建了rIL-12真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12,并建立了9L/rIL-12细胞株,为rIL-12基因修饰的胶质瘤疫苗研究打下了基础。

三氧化二砷诱导9L胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的研究三氧化二砷(As2O3)对鼠胶质瘤生长的影响及其机制。方法应用不同浓度As2O3,分别处理9L胶质瘤细胞株不同时间,采用四甲基噻唑蓝比色(MTT)法观察As2O3对9L胶质瘤细胞生长的影响,以透射电镜、Hoechst 33342/PI双染荧光及流式细胞仪检测9L胶质瘤细胞凋亡。结果不同浓度的As2O3均可显著抑制9L胶质瘤细胞株的生长。As2O3作用可引起9L胶质瘤细胞的凋亡,且随As2O3浓度的增大和作用时间的延长,9L胶质瘤细胞的凋亡率明显上升。结论As2O3在体外可显著抑制9L胶质瘤细胞生长,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关,且其凋亡率随As2O3作用的时间延长和剂量的增加而增加。

The 9L^(LUC)/Wistar rat glioma model is not suitable for immunotherapy

The availability of a well-characterized animal brain tumor model will play an important role in identifying treatments for human brain tumors. Wistar rats bearing 9L glioma cells can develop solid, well-circumcised tumors, and may be a useful animal model for the evaluation of various therapeutic approaches for gliosarcomas. In this study, the 9L/Wistar rat glioma model was produced by intracerebral implantation of 9L^LUC glioma cells syngenic to Fischer 344 （F344） rats. Bioluminescence imaging showed that tumors progressively grew from day 7 to day 21 in 9L^LUC/F344 rats, and tumor regression was found in some 9L^LUC/Wistar rats. Hematoxylin-eosin staining verified that intracranial tumors were gliomas. Immunohistochemistry results demonstrated that no CD4- and CD8-positive cells were found in the syngeneic 9L^LUC/F344 model. However, many infiltrating CD4- and CD8-positive cells were observed within the tumors of the 9L^LUC/Wistar model. Our data suggests that compared with 9L/F344 rats, 9L glioma Wistar rats may not be suitable for evaluating brain glioma immunotherapies, even though the model induced an immune response and exhibited tumor regression.

9L/Fischer 344大鼠颅内胶质瘤显微切除模型的建立

目的建立稳定的9L/Fischer 344大鼠颅内脑胶质瘤显微切除模型。方法采用立体定向技术,在Fischer 344大鼠右侧额叶尾状核接种5×104个9L细胞。在9L细胞种植后第7天应用神经外科显微技术近全切除大鼠颅内胶质瘤,分批处死动物。观察未手术大鼠及术后大鼠的生存状态及生存时间,观测颅内肿瘤的生长情况及形态学特点;通过免疫荧光法检测神经胶质酸性蛋白和中间丝蛋白在脑胶质瘤切除术前及术后复发肿瘤中的表达。结果未手术大鼠平均生存时间为(16.5±1.6)d,手术切除肿瘤可提高大鼠的生存状态,延长生存时间[术后大鼠的平均生存时间为(28.4±2.3)d],但最终会因肿瘤复发而死亡。免疫荧光法检测显示术后复发的肿瘤无论是形态学还是生物学特性方面与术前相比都无明显变化。结论近全切除9L/Fischer 344大鼠原位脑胶质瘤良好地模拟了人颅内脑胶质瘤手术切除的疾病发展过程,具备该肿瘤的形态学及生物学特性,模型成功。

9L/Fischer 344大鼠颅内胶质瘤模型的建立

目的建立稳定的9L/Fischer 344大鼠颅内脑胶质瘤模型。方法采用立体定向技术,在34只Fischer 344大鼠右侧额叶尾状核接种5×104个9L细胞。在接种9L细胞后第3、7、10和14天分别随机选取6只大鼠处死,1只的标本行冰冻切片处理,其余5只的标本行石蜡切片处理。余下10只大鼠自然死亡。观察大鼠的生存状态及生存时间,观测颅内肿瘤的生长情况及形态学特点;通过免疫荧光法检测神经胶质酸性蛋白(GFAP)和中间丝蛋白(Vimentin)在脑胶质瘤中的表达。结果 34只大鼠脑内均见肿瘤生长,成瘤率100%。大鼠平均生存时间为(16.5±1.6)d,在接种9L细胞初期无明显不良反应,随着肿瘤的生长而逐渐出现相应的表现,其过程符合临床脑胶质瘤的发展过程。HE结果显示Fischer 344大鼠颅内生长的9L胶质瘤具有该肿瘤的病理形态学特点,免疫荧光结果显示9L脑胶质瘤细胞高表达特异性的蛋白Vimentin,肿瘤周围有表达GFAP的胶质细胞。结论 9L/Fischer 344大鼠原位脑胶质瘤模型良好地模拟了人颅内脑胶质瘤的发展过程,具备该肿瘤的形态学及生物学特性,模型成功。

9L脑胶质瘤干细胞模型建立及MRI成像表现

目的：建立9L脑胶质瘤干细胞F344大鼠载瘤模型,采用3.0T磁共振成像评价肿瘤生长。方法：采用流式细胞仪分选CD133表达阳性细胞群,免疫荧光检测分选后细胞群的干细胞标记CD133、Nestin的表达情况。利用三维立体定向技术建立脑胶质瘤干细胞大鼠载瘤模型,定期行MR检查,观察颅内肿瘤生长情况。HE染色和免疫组织化学染色法观察肿瘤组织细胞形态和GFAP、S-100蛋白表达情况。结果：分选后细胞群CD133、Nestin蛋白表达阳性;干细胞荷瘤大鼠中位生存时间为（21.00±0.33）天;接种后1~3周MR扫描示肿瘤持续生长,增强扫描瘤体显像清晰,第3周末瘤周水肿显著;病理结果示肿瘤浸润生长,局部见出血、坏死,免疫组化示肿瘤组织胶质纤维GFAP阳性,S-100蛋白弱阳性。结论：流式技术分选9L脑胶质瘤干细胞建立的F344大鼠脑胶质瘤模型稳定可靠,符合恶性胶质瘤生物学特点;3.0T MR扫描仪能够动态观察脑胶质瘤生长状态。

慢病毒在大鼠胶质瘤细胞基因转导中的应用

目的应用慢病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因转导大鼠9L胶质瘤细胞。方法构建慢病毒表达质粒pLenti6/V5-TK并以PCR、酶切及测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统,将重组质粒与包装混合物(Packaging Mix)共同转染293T细胞生产假病毒颗粒,转染48 h后收集培养上清,用其感染大鼠9L胶质瘤细胞,以抗稻瘟菌素(BSD)筛选出9L-TK细胞。RT-PCR、Western blot方法检测TK基因在9L-TK细胞中的表达。用MTT方法测试更昔洛韦(GCV)对体外培养的9L-TK细胞杀伤效果。结果构建的重组质粒pLenti6/V5-TK经PCR、酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达2.7×105转导单位(TU)/ml。经BDS筛选获得的9L-TK细胞RT-PCR及Western blot结果显示TK基因表达阳性,且GCV对该细胞作用敏感。结论成功利用慢病毒实现了TK基因转导大鼠9L胶质瘤细胞。

大鼠脊髓髓内胶质瘤模型的构建及评价

目的优化大鼠脊髓髓内胶质瘤模型的构建方法,并对模型进行评估。方法 Fischer大鼠髓内注射9L胶质瘤细胞悬液,对肿瘤细胞的植入量、植入部位、植入深度等进行筛选优化,根据筛选好的指标构建大鼠脊髓髓内胶质瘤模型,采用BBB(Basso,Beattie,and Bresnahan)评分量表评估大鼠下肢神经功能,采用高分辨率MRI检查及病理免疫组化方法检查模型大鼠肿瘤形成情况,评估模型构建效果。结果大鼠脊髓内植入9L胶质瘤细胞悬液构建大鼠髓内胶质瘤模型的优化指标为:植入平面在脊柱T10水平,植入量为6μL(1.0×105/mL)细胞悬液,植入位置在硬脊膜平面下3mm。植入9L胶质瘤细胞后2周左右大鼠出现明显的下肢神经功能障碍。影像学和病理学检查证实髓内有肿瘤细胞生长。结论成功构建大鼠髓内胶质瘤模型,为后续研究奠定了基础。

9L/Fischer344与C6/Wistar两种大鼠脑胶质瘤模型的比较研究

目的探讨9L/Fischer344和C6/Wistar两种大鼠脑胶质瘤模型的对比研究。方法采用立体定向技术,大鼠脑内接种定量的肿瘤细胞建立模型,比较两种模型大鼠脑内肿瘤生长情况;采用免疫组织化学方法,比较两种模型脑内肿瘤局部细胞免疫反应情况。结果(1)9L/Fischer344大鼠脑内有肿瘤持续生长,而C6/Wistar大鼠脑内早期可见肿瘤生长,但肿瘤局部有大量淋巴细胞浸润,肿瘤周边血管呈现“淋巴细胞血管套”现象,后期脑内肿瘤逐渐消退、消失,仅见残留轨迹和含褐色素沉着的吞噬细胞;(2)9L/Fischer344肿瘤局部可见CD68阳性细胞,未见CD4、CD8阳性细胞,而C6/Wistar肿瘤局部CD68阳性细胞数量明显较9L模型多(P<0.01),并可见CD4、CD8阳性的淋巴细胞。结论9L/Fischer344模型稳定性高,重复性好,肿瘤局部T淋巴细胞浸润极少,是一种较为理想的脑胶质瘤免疫治疗研究的动物模型;C6/Wistar模型脑内肿瘤不能持续生长,脑内肿瘤可自发性消退,肿瘤局部T淋巴细胞浸润明显,存在较强的细胞免疫反应,可能是肿瘤的消退的原因,该模型不适合用于胶质瘤治疗,尤其是免疫治疗的实验研究。

9L／Wistar大鼠脑胶质肉瘤模型的建立

目的建立稳定的9L／Wistar大鼠脑胶质肉瘤模型。方法构建稳定表达萤火虫荧光素酶PGL的9L细胞株9L^lvc，采用立体定向手术，在Wistar大鼠右侧尾状核接种DAPI荧光标记的9L^lvc细胞，分别于接种后第7，14，21天通过Xenogen活体动物体内成像系统检测肿瘤的生长情况，并断头取材，观察肿瘤的形态学变化，采用免疫组化的方法检测肿瘤细胞胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白（Vemintin）的表达。结果大鼠接种9L^lvc细胞后成瘤率100％。活体成像显示细胞接种后第7天到第21天肿瘤呈逐渐增大趋势。组织切片结果显示肿瘤与周围脑组织边界较清楚，未见包膜；瘤内新生血管丰富，可见出血。肿瘤组织免疫组织化学GFAP及Vemintin蛋白染色阴性。结论该方法建立的大鼠脑胶质肉瘤模型稳定可靠，符合恶性胶质肉瘤的生物学特征．是理想的脑胶质肉瘤实验研究材料。

氩氦冷冻治疗9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤模型的病理学研究

目的 探讨氩氦冷冻治疗9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤模型的病理改变. 方法 种植9L胶质瘤细胞于30只Fischer344大鼠鼠背建立9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤模型,并按随机数字表法分为空白对照组（自然生长,不进行任何处理）和氩氦冷冻组（给予氩氦冷冻治疗）.接种后30d取出肿瘤组织进行病理学观察,应用HE染色、电镜下观察冷冻消融的肿瘤组织形态,应用免疫组织化学染色检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100蛋白表达. 结果 （1）光镜下空白对照组肿瘤细胞巢状排列紧密,肿瘤无包膜,瘤周小血管扩张,可见肿瘤细胞沿小血管浸润生长；瘤内新生血管丰富,瘤内常见出血、凝固性坏死灶.高倍镜下肿瘤细胞形态多样,核大深染、多核,异型性高.肿瘤细胞GFAP、S-100染色阴性,肿瘤细胞间胶质网可见阳性染色.（2）氩氦冷冻组HE染色显示冷冻中央区呈均匀性凝固性坏死,边缘区的炎性反应带主要为一些细胞碎片及大量的红、白细胞浸润：微血管内也发现大量的红细胞、血小板集合和血栓形成,并可见灶性出血.电镜显示冷冻区中央、边缘区组织细胞全部坏死或凋亡. 结论 氩氦刀可能是治疗胶质瘤有效的方法.

砷剂对胶质瘤细胞的促凋亡作用

目的研究三氧化二砷（As2O3）对不同胶质瘤细胞系的作用以及机制。方法应用MTT法观察As2O3对细胞生长的影响，并用透射电镜、Hoechst 33342／PI双染荧光和TUNEL观察C6胶质瘤细胞与9L胶质肉瘤细胞凋亡的形态变化；Annexin-v-FITC／PI双标记法检测细胞凋亡率。结果MTT法发现As2O3在0．5～8．0μmol／L的浓度均可显著抑制C6与9L胶质瘤细胞株的生长；透射电镜、Hoechst 33342／PI双染荧光和TUNEL观察均显示两种胶质瘤细胞发生了显著的凋亡形态改变；Annexin-v-FITC／PI法检测显示随As2O3浓度的增大和时间的延长，C6与9L胶质瘤细胞株的凋亡率明显上升，而在相同时间及浓度下9L胶质瘤细胞株凋亡率要小于C6胶质瘤细胞株。结论As2O3可诱导C6和9L胶质瘤细胞株产生凋亡，并且其作用具有选择性。

TK基因慢病毒载体质粒的构建及慢病毒表达系统的建立

目的:构建人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的慢病毒载体质粒,并建立其慢病毒表达系统。方法:利用酶切分别获取目的基因TK片段及慢病毒pLenti6/V5载体片段,将目的基因插入载体相应酶切位点,构建pLenti6/V5-TK质粒。构建的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定。利用慢病毒表达系统(ViraPowerTMLentiviral Ex-pression Systems),将重组质粒与包装系统质粒(pLP1,pLP2,pLP/VSVG)4质粒共转染293T细胞,48h后收集培养上清并感染大鼠胶质瘤细胞9L,抗稻瘟菌素(blasticidin,BSD)筛选9L/TK细胞。MTT方法测试更昔洛韦(ganci-clovir GCV)对体外培养的9L/TK细胞杀伤效果。结果与结论:构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达2.7×105转导单位(transducing units,TU)/ml。经BDS筛选的9L/TK细胞对GCV杀伤敏感。成功构建了TK基因慢病毒载体质粒pLenti6/V5-TK,并建立了其慢病毒表达系统。

大鼠IL-12基因双亚基真核表达质粒的构建及表达

目的构建双亚基共表达的大鼠白细胞介素12(rIL-12)基因真核表达载体质粒。方法用Trizol提取大鼠腹腔巨噬细胞总RNA,RT-PCR方法分别获取rp40和rp35两个亚基的cDNA,依次克隆入pcDNA3.1(-)/myc-His A质粒中,以脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点连接双亚基,构建成双顺反子真核表达载体质粒pcDNA3.1/rIL-12。用电转染法将构建的重组质粒转染大鼠胶质瘤9L细胞,G418筛选单克隆细胞株,ELISA法检测其培养上清rIL-12(p70)蛋白含量,同时抽提细胞RNA,RT-PCR方法检测rp40、rp35基因在9L/rIL-12细胞中的表达。结果所得rp40 cDNA序列与GenBank NM022611和AF133197、rp35 cDNA序列与GenBank NM053390和AF177031均一致,构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。质粒转染9L细胞,获得9L/rIL-12单克隆细胞株,其培养上清rIL-J2(p70)蛋白含量达139.0～162.1 PG/mL,RT-PCR结果显示细胞中rIL-12基因表达阳性。结论成功构建并鉴定了大鼠IL-12真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12。

骨髓基质干细胞向大鼠脑胶质瘤的趋向迁移作用

目的研究骨髓基质干细胞（BMSCs）向大鼠脑胶质瘤的趋向性。方法在体外分离培养Fisher344大鼠BMSCs，流式细胞仪检测细胞免疫表型；Transwell法分别将BMSCs、NIH3T3细胞与9L细胞进行共培养．24h后计算细胞迁移率；立体定向法建立Fisher344大鼠／9L细胞脑胶质瘤模型，2周后经神经行为学、MRI、HE染色证实模型成功后，将5-溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）标记的BMSCs、NIH3T3细胞由颈内动脉进行移植，2周后，Fisher344大鼠灌注固定取脑，免疫组织化学检测BMSCs的趋向迁移规律。结果体外分离培养的3～6代BMSCs表面标志CD34、CD45阴性而CD29、CD44阳性：BMSCs存体外能够向9L细胞迁移；立体定向法建立Fisher344大鼠／9L细胞脑胶质瘤模型符合胶质瘤的特征：颈内动脉移植的BMSCs也能够向9L细胞胶质瘤趋向迁移，主要分布在肿瘤组织与正常组织的边界。结论BMSCs在体内、外均能够向脑胶质瘤迁移，颈内动脉移植是一种简单、有效的方法。