miR-582-5p靶向调控FOXO1对新生大鼠缺血缺氧性脑病神经元损伤的影响

目的 探讨微小RNA-582-5p(miR-582-5p)靶向调控叉头框转录因子1(FOXO1)对新生大鼠缺血缺氧性脑病(HIE)神经元损伤的影响。方法 90只新生大鼠按照随机数字表法均分为对照(NC)组、模型(HIE)组、miRNA对照(LV-miRNA-NC)组、miR-582-5p过表达(LV-miR-582-5p)组、miR-582-5p过表达+mRNA对照(LV-miR-582-5p+LV-NC)组、miR-582-5p过表达+FOXO1过表达(LV-miR-582-5p+LV-FOXO1)组。除NC组外的各组大鼠建立HIE模型,对大鼠进行神经功能缺损评分,TTC染色测定脑梗死体积,Real-time PCR检测miR-582-5p和FOXO1表达,双萤光素酶报告基因实验检测miR-582-5p和FOXO1靶向关系,HE染色观察海马组织病理变化,TUNEL和Neu N荧光双标共定位检测海马组织神经元凋亡,免疫组化染色检测FOXO1、胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达。结果miR-582-5p和FOXO1具有靶向关系,与NC组比较,HIE组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、FOXO1表达、神经元凋亡率、FOXO1、Caspase-3蛋白表达增加,miR-582-5p表达降低,海马组织出现病理损伤(P<0.05);与LVmiRNA-NC组比较,LV-miR-582-5p组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、FOXO1表达、神经元凋亡率、FOXO1、Caspase-3蛋白表达降低,miR-582-5p表达增加,海马组织病理损伤好转(P<0.05);LV-FOXO1可以逆转LV-miR-582-5p对于HIE大鼠神经元损伤的保护作用。结论 miR-582-5p可以直接靶向负调控FOXO1表达,减少HIE新生大鼠神经元凋亡,对神经损伤具有保护作用。

miR-224-5p调控PI3K/Akt/FoxO1轴抑制氧化应激减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

目的 探究miRNA-224-5p在缺氧/复氧(H/R)诱导心肌细胞损伤中的作用机制。方法 收集160例急性心肌梗死(AMI)患者和80例健康体检者(HC)的血浆检测miRNA-224-5p及生化指标。H9c2细胞分为对照组(Control)、H/R组、H/R+miR-224-5pNC组、H/R+miR-224-5p mimics组。噻唑蓝(MTT)检测细胞活力;试剂盒检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶2(SOD2)和乳酸脱氢酶(LDH);双荧光素酶报告基因实验验证miR-224-5p与PTEN的靶向关系;生物信息学方法对靶基因的潜在机制进行分析;qRT-PCR检测miRNA-224-5p mRNA表达;Western blotting检测PTEN、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、SOD2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Ak及p-FoxO1/FoxO1蛋白水平;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 与HC组相比,AMI组的血糖、 C反应蛋白、CK、CK-MB和cTnI水平均显著高于对照组(P<0.05)。AMI组和H/R组miR-224-5p的表达低于对照组(P<0.05);心肌细胞活力呈缺氧/复氧时间依赖性减少;PTEN是miR-224-5p的靶基因;PI3K/Akt通路是最显著富集的通路;与Control组相比,H/R组SOD2的活性降低,LDH的活性和MDA的含量均上升,细胞凋亡率上升(P<0.05),细胞中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1、SOD2和Bcl-2蛋白表达水平均降低,PTEN、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达均升高(P<0.05);与H/R组比较,H/R+miR-224-5p mimics组SOD2的活性显著上升,LDH、MDA的水平和细胞凋亡率均显著降低(P<0.05),细胞中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1、SOD2和Bcl-2的表达均上调,PTEN、Bax和Cleaved caspase3蛋白表达水平均降低(P<0.05)。结论 miR-224-5p过表达通过PI3K/Akt/FoxO1轴上调抗氧化基因SOD2的表达,缓解H/R诱导的H9c2细胞的氧化应激,减少细胞凋亡。

cGAS-STING通路调控NCOA4介导的铁自噬在HT22细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的探讨环鸟苷酸—腺苷酸合成酶(cGAS)-干扰素基因刺激蛋白(STING)通路调控核受体共激活因子4(NCOA4)介导的铁自噬在小鼠海马神经细胞(HT22)缺氧复氧损伤中的作用。方法2020年9月—2022年12月于武汉大学人民医院中心实验室进行实验。将HT22细胞系随机分为4组,对照组(Ctrl组)、缺氧复氧组(HR组)、缺氧复氧+cGAS抑制剂(RU.521)组(HR+RU组)、缺氧复氧+RU.521+NCOA4过表达组(HR+RU+NCOA4组)。HR组于无糖缺氧条件下培养6 h再复糖复氧培养24 h构建缺氧复氧模型,HR+RU组及HR+RU+NCOA4组提前给予3.0μmol/L的RU.521处理24 h后构建缺氧复氧模型,HR+RU+NCOA4组于缺氧复氧前5 d给予NCOA4慢病毒转染,对照组常规培养。免疫荧光检测各组ROS,ELISA检测CCK8、LDH、SOD、MDA及亚铁离子,Western blot检测cGAS、STING、NCOA4、LC3B和铁蛋白。结果与Ctrl组比较,HR组细胞活力CCK8、SOD降低,LDH、ROS、MDA、cGAS、STING、NCOA4、LC3B、铁蛋白、亚铁离子升高(P<0.05);与HR组比较,HR+RU组细胞活力CCK8、SOD、铁蛋白升高,LDH、ROS、MDA、cGAS、STING、NCOA4、LC3B、亚铁离子降低(P<0.05);与HR+RU组比较,HR+RU+NCOA4组细胞活力CCK8、SOD、铁蛋白降低(P<0.05),LDH、ROS、MDA、NCOA4、LC3B、亚铁离子升高(P<0.05),cGAS、STING差异无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧复氧后HT22细胞cGAS-STING通路上调,NCOA4介导的铁自噬过度激活进而加重细胞损伤。

Caco-2细胞单层缺氧再复氧损伤的模型构建

目的构建Caco-2细胞单层缺糖、缺血清、缺氧,再复糖、复血清、复氧的损伤模型,探究一氧化碳释放分子3(CORM-3)对Caco-2细胞单层缺氧再复氧损伤模型的影响。方法首先,培养Caco-2细胞,于37℃、含5%CO_(2)、1%O_(2)与94%N_(2)的培养箱中缺氧,建立Caco-2细胞单层缺糖、缺血清、缺氧/复糖、复血清、复氧(H/R)模型。根据缺氧时间分4组,空白对照组(Control组)、H/R 1组(缺氧4 h、复氧4 h)、H/R 2组(缺氧8h、复氧4h)和H/R 3组(缺氧12 h、复氧4 h)。其次,溶解CORM-3药物粉末并制备无活性的CORM-3(iCORM-3),按药物浓度分6组,空白对照组(Control组)、缺氧、复氧损伤模型组(H/R组)、H/R+300μmol/L CORM-3(H/R+C1组)、H/R+400μmol/L CORM-3(H/R+C2组)、H/R+500μmol/L CORM-3(H/R+C3组)和H/R+500μmol/L iCORM-3(H/R+C4组)。主要采用Cell counting kit-8(CCK8)试剂盒检测细胞活力,倒置显微镜观察细胞形态变化,测定Caco-2细胞单层渗透性。结果随着缺氧时间的延长,可观察到Caco-2细胞间连接消失,细胞皱缩从培养瓶底脱落漂浮,细胞活力下降,细胞单层通透性增大。给予CORM-3药物干预处理后,相比于未干预损伤组Caco-2细胞均有不同程度的改善,细胞活力随着药物浓度的增加而上升。结论本研究成功构建Caco-2细胞单层缺氧再复氧的损伤模型,并发现CORM-3对Caco-2细胞单层H/R损伤模型可能有保护作用。

乌司他丁通过上调Cx43表达减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞铁死亡的作用机制

目的探讨乌司他丁(UTI)对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞铁死亡的影响,并分析其保护机制。方法体外培养大鼠H9c2心肌细胞,分为对照组、H/R组、铁死亡诱导剂(Erastin)组、UTI组、UTI+Erastin组、UTI+小干扰RNA(siRNA)阴性对照(si-NC)组、UTI+连接蛋白43(Cx43)siRNA(si-Cx43)组,各组给予相应干预后,检测各组细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、活性氧、Fe^(2+)、丙二醛、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及Cx43、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁蛋白重链1(FTH1)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)mRNA和蛋白水平。结果与对照组比较,H/R组细胞活力、SOD、CAT活性和Cx43、GPX4、FTH1mRNA及蛋白水平显著降低,LDH活性、活性氧、丙二醛、Fe^(2+)和ACSL4mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.01)。与H/R组比较,UTI组细胞活力[(71.40±8.05)%vs(42.63±6.71)%]、SOD、CAT活性和Cx43、GPX4、FTH1mRNA及蛋白水平显著升高,LDH活性、活性氧、丙二醛、Fe^(2+)和ACSL4mRNA及蛋白水平显著降低(P<0.05)。与UTI组比较,UTI+Erastin组和UTI+si-Cx43组细胞活力、SOD、CAT活性和Cx43、GPX4、FTH1mRNA及蛋白水平显著降低,LDH活性、活性氧、丙二醛、Fe^(2+)和ACSL4mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论UTI可能通过上调Cx43抑制H/R诱导的心肌细胞铁死亡。

臭氧氧化+A/O+臭氧氧化工艺在化工园区污水处理厂中的运用

化工园区废水成分复杂,难降解物质多。某化工园区污水处理厂选用分质强化混凝沉淀+臭氧氧化作为预处理工艺,同时采用水解酸化+厌氧好氧(Anaerobic/Oxic,A/O)的二级处理工艺和混凝沉淀+臭氧氧化的深度处理工艺。实际运行结果表明,该组合工艺对化学需氧量(Chemical Oxygen Demand,COD)的平均去除率为85.7%,COD去除效果良好,出水水质优于《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918—2002)的一级A标准。

血管内皮生长因子165/骨形态发生蛋白改善缺氧复氧状态下成骨细胞损伤

背景:研究发现,血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白两种因子在缺氧复氧过程中相互作用,通过调节细胞内信号通路的活化,参与骨细胞损伤的修复过程。目的:进一步探究血管内皮生长因子165/骨形态发生蛋白与缺氧复氧成骨细胞损伤的关系分析。方法:取成骨细胞,建立缺氧复氧损伤模型,建模前后Real-Time PCR法和免疫印迹法检测血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白2的mRNA及蛋白表达。分别给予建模后成骨细胞不同质量浓度(10,20,40ng/mL)血管内皮生长因子165或骨形态发生蛋白2处理12,24,36,48,72 h,CCK-8法检测细胞增殖,DAPI检测细胞凋亡。结果与结论:(1)与建模前相比,建模后成骨细胞中血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白2的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05);(2)成骨细胞增殖率随着血管内皮生长因子165质量浓度的升高而明显升高(P<0.05);成骨细胞凋亡率随着血管内皮生长因子165质量浓度的升高而明显降低(P<0.05);(3)成骨细胞增殖率随着骨形态发生蛋白2质量浓度的升高而明显升高(P<0.05);成骨细胞凋亡率随着骨形态发生蛋白质量浓度的升高而明显降低(P<0.05);(4)结果表明,血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白在缺氧复氧成骨细胞损伤中低表达,给予血管内皮生长因子165、骨形态发生蛋白处理后缺氧复氧成骨细胞损伤明显降低,且呈浓度依赖性,提示血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白对缺氧复氧成骨细胞损伤有明显保护作用。

利多卡因通过降低微小RNA-181a表达抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

目的 探讨利多卡因通过调控微小RNA-181a(miR-181a)对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞H9C2损伤的影响。方法 培养H9C2细胞,建立H/R模型,作为H/R组;正常培养的细胞作为对照(Con)组。使用1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L利多卡因处理H/R诱导的H9C2细胞,并分别设为1.0μmol/L组、2.5μmol/L组、5.0μmol/L组、10.0μmol/L组和20.0μmol/L组。将anti-miR-NC、anti-miR-181a分别转染至H/R诱导的H9C2细胞,记为H/R+anti-miR-NC组、H/R+anti-miR-181a组。将miR-NC、miR-181a分别转染至H/R诱导的H9C2细胞,再用20.0μmol/L利多卡因处理,分别记为H/R+miR-NC+20.0μmol/L组、H/R+miR-181a+20.0μmol/L组。采用MTT实验检测细胞活性;采用流式细胞术检测细胞凋亡;采用蛋白质印迹(Western blot)检测细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-181a表达;检测丙二醛(MDA)含量及乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测炎性因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)]的水平。结果 与Con组相比,H/R组细胞活性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与H/R组相比,5.0μmol/L组、10.0μmol/L组和20.0μmol/L组的细胞活性提高,差异有统计学意义(P<0.05)。因此,后续以20.0μmol/L利多卡因进行实验。与Con组相比,H/R组细胞凋亡率、Caspase-3蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与H/R组相比,20.0μmol/L组细胞凋亡率、Caspase-3蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与Con组相比,H/R组MDA含量、LDH活性以及炎症因子水平提高,SOD活性降低,差异有统计学意义(P<0.05);与H/R组相比,20.0μmol/L组MDA含量、LDH活性以及炎性因子水平降低,SOD活性提高,差异有统计学意义(P<0.05)。与H/R+anti-miR-NC组相比,H/R+anti-miR-181a组细胞miR-181a表达、凋亡率和Caspase-3蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与H/R+anti-miR-NC组相比,H/R+anti-miR-181a组MDA含量、LDH活性以及炎性因子水平降低,SOD活性升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与H/R+miR-NC+20.0μmol/L组相比,H/R+miR-181a+20.0μmol/L组细胞凋亡率、Caspase-3蛋白和MDA含量、LDH活性以及炎性因子水平升高,SOD活性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 利多卡因通过干扰miR-181a表达,抑制H/R诱导的心肌细胞H9C2损伤。

咪达唑仑通过上调miR-320抑制缺氧/复氧诱导的PC12细胞凋亡

目的 为了明确咪达唑仑在缺血性中风中的作用,探讨咪达唑仑对缺氧/复氧(H/R)诱导的PC12细胞增殖和凋亡的影响和潜在机制。方法 体外培养PC12细胞,分为Control组、H/R组、不同剂量咪达唑仑组、10μmol/L咪达唑仑+anti-miR-NC组、和10μmol/L咪达唑仑+anti-miR-320组;CCK-8法和流式细胞术分别用于检测细胞增殖和凋亡;Western Blot检测蛋白表达;RT-qPCR检测miR-320表达。结果 与Control组相比,H/R组细胞A值(0.43±0.02)、pro-caspase3水平(0.14±0.01)和miR-320表达(0.15±0.01)显著降低(P<0.05),而凋亡率(26.68±0.81)和Cleaved-caspase3水平(0.70±0.05)显著升高(P<0.05)。与H/R组相比,不同剂量(0.1、1.0、10μmol/L)咪达唑仑组细胞A值(0.43±0.02、0.57±0.03、0.93±0.04)、pro-caspase3水平(0.14±0.01、0.30±0.02、0.52±0.03)和miR-320表达(0.15±0.02、0.42±0.03、0.81±0.05)显著升高(P<0.05),而凋亡率(25.65±0.92、21.74±0.56、15.63±0.50)和Cleaved-caspase3水平(0.70±0.06、0.50±0.04、0.23±0.02)显著降低(P<0.05),且呈剂量依赖性。与10μmol/L咪达唑仑+anti-miR-NC组相比,10μmol/L咪达唑仑+anti-miR-320组细胞A值(0.47±0.02)、pro-caspase3水平(0.24±0.01)和miR-320表达(0.26±0.02)显著降低(P<0.05),而凋亡率(23.52±0.59)和Cleaved-caspase3水平(0.56±0.04)显著升高(P<0.05)。结论 咪达唑仑可以上调miR-320表达,进而促进H/R诱导的PC12细胞增殖,并抑制凋亡。

三叶青黄酮通过TLR4/NF-κB通路调控NLRP3小体激活改善大鼠心肌细胞缺氧再复氧损伤的作用及机制

目的探究三叶青黄酮(RTHF)对大鼠心肌细胞缺氧再复氧(H/R)损伤的作用及其可能机制。方法以大鼠心肌细胞H9C2为研究对象,分为对照组、H/R组、H/R+低浓度RTHF(L-RTHF)组(25μg/mL)、H/R+中浓度RTHF(M-RTHF)组(50μg/mL)和H/R+高浓度RTHF(H-RTHF)组(100μg/mL)。通过CCK-8法检测各组细胞活力;试剂盒检测各组细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)含量;DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、消皮素D的N端切割产物(GSDMD-N)、Toll样受体4(TLR4)、磷酸化核因子κB p65(p-NF-κB p65)、核因子κB p65(NF-κB p65)的表达水平。结果与对照组比较,H/R组H9C2细胞活力[(71.33±1.70)%比(100.00±2.94)%,P<0.01]、SOD水平[(15.54±0.36)U/mg prot比(34.54±0.87)U/mg prot,P<0.01]降低,ROS相对DCF强度[(3.72±0.12)比(1.00±0.10),P<0.01]和LDH水平[(387.57±9.37)U/L比(182.80±11.53)U/L,P<0.01]升高,NLRP3[(2.75±0.04)比(1.00±0.02)、(4.71±0.18)比(1.00±0.11),P<0.01]、Caspase-1[(3.02±0.11)比(1.00±0.06)、(3.33±0.09)比(1.00±0.12),P<0.01]、ASC[(3.32±0.12)比(1.00±0.09)、(5.30±0.15)比(1.00±0.10),P<0.01]、GSDMD-N[(3.69±0.14)比(1.00±0.13)、(3.23±0.08)比(1.00±0.06),P<0.01]、TLR4[(4.00±0.12)比(1.00±0.09)、(5.68±0.20)比(1.00±0.10),P<0.01]、p-NF-κB p65[(6.81±0.16)比(1.00±0.10)、(3.25±0.07)比(1.00±0.05),P<0.01]相对mRNA和蛋白水平升高;与H/R组比较,H/R+M-RTHF组和H/R+H-RTHF组的细胞活力[(77.00±2.16)%、(82.00±2.16)%比(71.33±1.70)%,P<0.05或P<0.01]、SOD水平[(23.43±1.50)U/mg prot、(28.66±1.22)U/mg prot比(15.54±0.36)U/mg prot,P<0.05或P<0.01]升高,ROS[(3.24±0.05)、(2.57±0.04)比(3.72±0.12),P<0.05或P<0.01]、LDH[(332.77±5.76)U/L、(253.36±9.43)U/L比(387.57±9.37)U/L,P<0.05或P<0.01]水平降低,NLRP3[(1.86±0.06)、(1.56±0.09)比(2.75±0.04),(2.97±0.11)、(1.86±0.06)比(4.71±0.18),P<0.05或P<0.01]、Caspase-1[(2.06±0.13)、(1.27±0.06)比(3.02±0.11),(2.12±0.15)、(1.42±0.09)比(3.33±0.09),P<0.05或P<0.01]、ASC[(2.40±0.25)、(2.19±0.14)比(3.32±0.12),(2.46±0.08)、(1.28±0.05)比(5.30±0.15),P<0.05或P<0.01]、GSDMD-N[(2.43±0.07)、(2.19±0.13)比(3.69±0.14),(1.91±0.07)、(1.46±0.07)比(3.23±0.08),P<0.05或P<0.01]、TLR4[(3.52±0.09)、(1.88±0.11)比(4.00±0.12),(4.04±0.32)、(2.07±0.07)比(5.68±0.20),P<0.05或P<0.01]、p-NF-κB p65[(4.09±0.12)、(3.03±0.20)比(6.81±0.16),(1.93±0.31)、(1.39±0.12)比(3.25±0.07),P<0.05或P<0.01]相对mRNA和蛋白水平降低,且这种变化呈现RTHF剂量依赖性。结论在H/R诱导的大鼠心肌细胞中,RTHF可能通过抑制ROS和TLR4/NF-κB通路调控NLRP3小体激活,进而抑制细胞焦亡。

缺氧生物膜转型厌氧氨氧化生物膜培养与富集特性

接种西安市某污水处理厂缺氧池生物膜构建升流式厌氧固定床生物膜(UAFB)反应器从而富集培养厌氧氨氧化(Anammox)生物膜,通过测定生物膜Anammox活性和酶活性并进行高通量测序分析,探讨城市污水处理厂现有填料转型培养Anammox生物膜的可行性及生物膜内菌群演替规律.结果表明,经29d培养后的UAFB-Anammox反应器TN去除率高达76.22%,快速启动成功;负荷提升阶段,表面氮负荷(SNLR)由0.23g/(m^(2)·d)提升至2.59g/(m^(2)·d),最大Anammox活性维持2.15g/(m^(2)·d),TN去除率高达83.68%.Illumina MiSeq测序结果发现,富集后的生物膜中优势菌属为Ca.Brocadia,相对丰度为33.38%,富集效果明显.同时缺氧生物膜上反硝化菌Denitratisoma以Anammox的产物NO_(3)^(-)-N为基质,逐渐与AnAOB形成共生存关系.这说明利用城市污水处理厂现有缺氧生物膜可以快速培养Anammox生物膜,对Anammox工艺在城市污水处理厂升级改造中的应用提供一定参考.

miR-370-3p通过FOXO1/PI3K/AKT通路抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡

目的探讨微小RNA(miRNA/miR)-370-3p在缺氧/复氧(H/R)H9C2心肌细胞凋亡中的调控作用。方法建立H/R H9C2心肌细胞模型。正常培养的H9C2细胞记为对照组,用miR-370-3p模拟物(miR-370-3p mimic)、miR-370-3p模拟物NC(miR-370-3p mimic NC)不同处理方法处理H/R H9C2心肌细胞。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative fluorescence of reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞中miR-370-3p的表达水平,蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞中Caspase-3、FOXO1、PI3K、AKT、p-PI3K的表达水平,流式细胞术检测细胞的凋亡。结果与对照组相比,H/R组心肌细胞中miR-370-3p的表达下降,miR-370-3p的模拟转染明显增加了miR-370-3p的表达水平。H/R明显促进了H9C2心肌细胞的凋亡,转染miR-370-3p模拟物可明显减轻H9C2心肌细胞的凋亡。H/R处理后,凋亡蛋白caspase-3的水平升高,FOXO1的表达明显增加,p-AKT和p-PI3K的表达明显减少。转染miR-370-3p后,caspase-3与FOXO1的表达明显减少,p-AKT和p-PI3K的表达明显增高。结论miR-370-3p可能通过调控FOXO1/PI3K/AKT的表达抑制H/R诱导的H9C2心肌细胞的凋亡,为改善心肌I/R损伤提供一个新的治疗目标。

缺氧后处理通过piRNA-005854调控衰老心肌细胞自噬发挥保护心肌作用

背景:缺血后处理是减轻缺血再灌注损伤的有效方式之一,近年来被越来越广泛地应用于临床实践,但其具体分子机制还有待研究。目的:探讨piRNA-005854在衰老心肌细胞缺氧后处理中的作用及机制。方法:体外给予心肌细胞8 mg/mL D-半乳糖9 d诱导其衰老,β-半乳糖苷酶染色观察心肌细胞的衰老情况;衰老后细胞给予缺氧/复氧处理和缺氧后处理,ELISA检测心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶MB以及乳酸脱氢酶水平;Western blot检测衰老心肌细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62和ULK1及其磷酸化ULK1的表达;qRT-PCR检测piRNA-005854的表达水平;进一步用piRNA-005854 inhibitor及piRNA-005854 mimics转染衰老心肌细胞并进行缺氧后处理,Western blot检测LC3Ⅱ、p62和ULK1及其磷酸化ULK1的表达。结果与结论:①D-半乳糖诱导9 d后心肌细胞出现明显衰老;②与正常氧组比较,缺氧/复氧组肌酸激酶同工酶MB以及乳酸脱氢酶水平增加(P<0.01);LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高、p62表达降低、ULK1磷酸化水平升高、piRNA-005854表达升高(P<0.01);③与缺氧/复氧组比较,缺氧后处理组肌酸激酶同工酶MB以及乳酸脱氢酶水平明显减少(P<0.01);LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显降低(P<0.05)、p62表达升高(P<0.01)、ULK1磷酸化水平降低(P<0.05)、piRNA-005854表达降低(P<0.01);④转染piRNA-005854 inhibitor后,LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低(P<0.01),p62表达明显升高(P<0.05),ULK1磷酸化水平明显降低(P<0.01);转染piRNA-005854 mimics后,LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著升高,p62表达降低,ULK1磷酸化水平明显增加(P<0.01);⑤结果表明,piRNA-005854介导的ULK1依赖性自噬水平降低是衰老心肌细胞缺氧后处理发挥保护作用的可能机制。

成年小鼠心肌细胞腺病毒转染及缺氧/复氧诱导损伤模型的建立

目的 采用非Langendorff方法分离成年小鼠心肌细胞(adult mouse cardiomyocytes, AMCMs),并建立腺病毒转染及缺氧/复氧诱导细胞损伤模型,为应用AMCMs进行心肌缺血体外实验的研究提供便捷、实用、可操作性强的系统方法。方法 应用非Langendorff方法分离AMCMs,观察贴壁后2、24、48及72 h细胞的形态,计算存活率,并应用α-actinin免疫荧光染色观察AMCMs完整性;应用腺病毒转染AMCMs,观察并统计转染36、48 h后的转染效率;通过缺氧45 min/复氧24 h,进行碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色,统计PI阳性细胞率以明确缺氧/复氧损伤模型的建立。结果 与AMCMs贴壁后2 h相比,贴壁后24和48 h的细胞存活率无显著下降,贴壁后72 h的细胞存活率显著下降;AMCMs细胞结构完整,可进行腺病毒转染,36和48 h转染效率分别可达82.07%±0.60%和82.84%±1.18%;缺氧/复氧诱导AMCMs可成功建立细胞损伤模型,PI染色阳性细胞达42.28%±3.10%。结论 本研究应用非Langendorff方法分离培养的AMCMs,细胞存活率高,并建立腺病毒转染和缺氧/复氧诱导细胞损伤模型,为体外建立AMCMs基因修饰、缺氧/复氧损伤模型提供了简单易行的系统方法。

牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡

背景:牛磺熊去氧胆酸是一种亲水性胆汁酸衍生物,在多种神经系统疾病模型中均有神经保护作用,但目前鲜有报道研究牛磺熊去氧胆酸对脊髓损伤的作用。目的:观察缺糖缺氧条件下牛磺熊去氧胆酸对脊髓神经元凋亡的作用,以及对脊髓损伤后小鼠运动功能恢复的影响。方法:①体外实验:从孕13.5 d的C57 BL/6小鼠胚胎中分离提取原代脊髓神经元,培养72 h后,分3组处理:正常组加入Neurobasal完全培养基,置于CO_(2)培养箱(体积分数5%CO_(2)+95%空气)内培养24 h;氧糖剥夺组加入无糖的Neurobasal培养基,置于三气培养箱(体积分数94%N2+5%CO_(2)+1%O_(2))培养12 h,更换为Neurobasal完全培养基后置于CO_(2)培养箱内培养12 h;实验组处理过程大致同氧糖剥夺组,其中在加入无糖Neurobasal培养基的同时加入牛磺熊去氧胆酸。采用TUNEL染色检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞活性,免疫荧光染色检测细胞βⅢ微管蛋白表达。②动物实验:采用随机数字表法将60只C57 BL/6小鼠分为假手术组、脊髓损伤组与实验组,每组20只,脊髓损伤组与实验组采用Allen打击法建立T_(9)-T_(10)脊髓损伤模型,造模后第1天开始,实验组灌胃给予牛磺熊去氧胆酸溶液,假手术组与脊髓损伤组灌胃给予生理盐水,1次/d。连续给药14 d后,采用行为学和组织学方法评估脊髓组织修复情况。结果与结论:①体外实验:TUNEL染色、CCK-8与免疫荧光染色检测显示,氧糖剥夺组细胞凋亡数量高于正常组(P<0.01),细胞活性与βⅢ微管蛋白表达低于正常组(P<0.01);实验组细胞凋亡数量低于氧糖剥夺组(P<0.01),细胞活性与βⅢ微管蛋白表达高于氧糖剥夺组(P<0.01)。②动物实验:旷场实验BBB评分与后肢足迹实验显示,实验组小鼠行走与运动功能恢复程度好于脊髓损伤组。苏木精-伊红染色显示,脊髓损伤组小鼠脊髓损伤部位可见明显畸形和空洞,神经细胞数量明显减少;与脊髓损伤组比较,实验组脊髓损伤病变面积显著减小,脊髓畸形程度更小、空洞更少,神经细胞数量增加。免疫荧光染色显示,脊髓损伤组神经元胞核标记神经元细胞数量少于假手术组(P<0.01),实验组神经元胞核标记神经元细胞数量高于脊髓损伤组(P<0.01)。③结果表明:牛磺熊去氧胆酸能减少缺糖缺氧引起的脊髓神经元凋亡、轴突的丢失,促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复。

水解酸化+A2/O+AO+芬顿氧化工艺处理工业园区污水

针对工业园区的污水排放企业种类较多、进水水量水质波动较大、污染物复杂且可生化性差、排放标准高的特征,以浙江省德清县某工业园区实际污水处理工程为对象,分析了水解酸化+A2/O+AO+芬顿氧化工艺处理以印染、食品制造、金属加工企业为主的废水排放的技术经济可行性.实践结果显示,出水水质的COD、NH_(3)-N、TN及TP能稳定达到《城镇污水处理厂主要染物排放标准》(DB33/2169—2018)中的限值,其余指标达到《城镇污水处理厂染物排放标准》(GB18918—2002)的一级A标准;工程投资金额为8200元/m^(3),实际直接运行成本为2.39元/m^(3).

丹酚酸B通过调控AMPK介导的铁死亡保护缺氧/复氧诱导的肾小管上皮细胞的损伤

目的:探究丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)对于缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)所致肾小管上皮细胞损伤的保护作用及其机制。方法:体外实验细胞分组为正常对照(Con)组,Sal B+Con组、H/R组、Sal B+H/R组,以及Con组、H/R组、Sal B+H/R组、H/R+CC(Compound c,AMPK抑制剂)组、H/R+Sal B+CC组两部分。体外实验用CCK‑8法检测HK‑2细胞活性;细胞震碎,取上清,用酶标仪检测GSH和MDA的含量;Western blot检测p‑AMPK、GPX4、ACSL4和FSP1蛋白的表达情况;细胞免疫荧光检测铁死亡指标GPX4、ACSL4蛋白的表达情况;流式细胞术检测线粒体膜电位和细胞凋亡。结果:体外实验结果显示,Sal B在20~160μmol/L对正常HK‑2细胞活性无明显毒性(P>0.05);与模型组相比,20、40、80μmol/L的Sal B呈剂量依赖性提高HK‑2细胞的活性(P<0.01)。与模型组相比,H/R+Sal B组细胞MDA含量降低,GSH含量升高,p‑AMPK、GPX4和FSP1蛋白的表达水平升高,ACSL4蛋白的表达降低,细胞线粒体膜电位显著升高,细胞凋亡率显著下降(P<0.05);H/R+AMPK组较H/R+Sal B组FSP1和GPX4蛋白表达水平降低,ACSL4蛋白的表达水平升高(P<0.05),细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.05),加入Sal B可以逆转这一情况(P<0.05)。结论:Sal B可减轻H/R的肾小管上皮细胞的损伤,其机制可能与激活AMPK通路减轻肾小管上皮细胞铁死亡有关。

注射用丹参多酚酸联合血栓通对缺氧复氧损伤血脑屏障紧密连接蛋白表达的影响

血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通过精密控制血液与脑实质之间的物质交换维持脑内微环境,保证神经系统功能。脑微血管内皮细胞作为组成BBB的核心,通过细胞间紧密连接蛋白(tight junction protei,TJs)来维持BBB的屏障完整[1-2]。研究表明[3-4],BBB的破坏是造成缺血性卒中出血转化及加重脑损伤的重要因素。因此,维持BBB的完整可能是缺血性卒中的重要治疗策略。

类视黄醇X受体对缺氧/复氧诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激反应的调控作用

目的:探讨类视黄醇X受体(RXR)在缺氧/复氧(HR)诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)氧化应激反应中的调控作用。方法:随机将细胞实验分成5组:对照(C)组、HR组、HR+溶剂二甲基亚砜(DMSO)组(HD组)、HR+RXR激动剂9-顺式维甲酸(9-RA)组(RA组)和HR+RXR抑制剂HX531组(HX组)。采用CCK-8法检测各组细胞活力;免疫荧光法进行AECⅡ特异性指标表面活性物质蛋白A(SP-A)的鉴定和RXRα表达的观察;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;透射电镜观察细胞内超微结构的变化;Western blot检测核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白水平;RT-PCR检测Nrf2的mRNA表达水平。结果:与C组相比,HR、HD、RA和HX组细胞活力均显著降低(P<0.05),SOD活性显著下降(P<0.05),MDA含量显著增高(P<0.05),Nrf2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),RXRα的免疫荧光表达显著增加(P<0.01);与HR和HX组相比,RA组细胞活力增加(P<0.05),SOD活性上升(P<0.05),MDA含量下降(P<0.05),Nrf2的mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01),RXRα的免疫荧光表达显著增加(P<0.01)。结论:HR可加剧大鼠AECⅡ的氧化应激反应,RXR激动剂干预后可通过抑制氧化应激反应减轻HR引起的大鼠AECⅡ损伤。

YTHDF1对缺氧复氧损伤后H9c2心肌细胞凋亡及氧化应激的影响

目的探讨含YTH域家族蛋白1(YTHDF1)对缺氧复氧(H/R)条件下H9c2细胞凋亡和氧化应激的影响。方法用H9c2细胞构建H/R模型,并用YTHDF1小干扰RNA(siRNA)和过表达质粒转染细胞,采用MTT比色法测定细胞活力,并用赫斯特染色及流式细胞术测定细胞凋亡及细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和细胞培养基上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性,Western blot法测定细胞中YTHDF1、cleaved caspase-3、Bax和FasL的蛋白水平,比较对照组(control组)、H/R组、YTHDF1基因干扰和过表达组H9c2细胞凋亡和氧化损伤情况。结果H/R损伤后LDH活性和MDA含量明显升高(P<0.05),SOD活性和细胞活力显著降低(P<0.05),H/R处理后H9c2细胞中YTHDF1的蛋白水平均显著升高(P<0.05);YTHDF1干扰减轻了H/R损伤引起的形态学变化,YTHDF1过表达增加了H/R损伤引起的细胞形态变化;H/R损伤处理后cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白表达显著高于control组(P<0.05);H/R+YTHDF1-siRNA组cleaved caspase-3、Bax和FasL的蛋白水平显著低于H/R组(P<0.05),H/R+pcDNA3.1-YTHDF1组cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白水平显著高于H/R组(P<0.05)。结论下调YTHDF1可以抑制H/R处理的H9c2细胞cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白水平的上调并降低H/R处理的心肌细胞氧化损伤。