Aβ斑块显像剂:^(11)C-PIB的合成及标记

11C标记2-(4′-N-11C-甲胺基苯)-6-羟基苯并噻唑(6-OH-BTA-1)是目前较理想的Aβ斑块显像剂,本研究合成了6-OH-BTA-1的前体:6-羟基-2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑,并用11C标记。在常温下,无需保护羟基条件下,标记效率为52.6%(校正,n=35),产品放射化学纯度大于99%,比活度为18.0 TBq/mmol。80℃加热2 min,有副反应发生。采用弱酸性流动相,半制备HPLC分离后产品的放射化学纯度达99%。

新型Aβ斑块显像剂^(18)F-W372

合成诊断阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的Aβ斑块显像剂:7-甲氧基-2(6-[18 F]-氟-吡啶-3-基)咪唑[2,1-β]-8-吡啶噻唑(18F-W372),不校正合成效率为(25.3±7.1)%(n=6),产品放化纯大于99.5%,比活度为659～721PBq/mol。18 F-W372小鼠体内分布实验显示,初始5min脑摄取为(4.36±1.44)%ID/g,清除较快,30min为(0.54±0.16)%ID/g,摄取比达到8,具有良好的生物学性能。急性毒性实验表明该药物安全可靠。在体试验显示药物注射40min,AD患者平均皮层/小脑吸收显著高于健康老年对照组。18 F-W372是一种潜在的脑内Aβ淀粉显像剂。

^(125)Ⅰ标记的二噻吩查尔酮类Aβ斑块显像剂的制备与生物评价

合成了溴代、碘代二噻吩查尔酮类Aβ斑块分子探针,体外荧光染色实验证实,两个化合物都能与AD转基因小鼠脑切片上的Aβ斑块特异性结合,竞争结合实验进一步证实与Aβ聚集体有较高的亲和力,Ki值分别为2.33nM和0.88nM。以三丁基锡化合物为标记前体,采用锡-卤交换法进行125I标记,标记率和放化纯度均大于99%,体外放射自显影结果表明,125I标记的二噻吩查尔酮类化合物能够特异性地标记AD转基因小鼠脑切片上Aβ斑块,且与硫磺素-S的染色结果对应。正常小鼠生物分布实验结果表明,该探针穿过血脑屏障的能力较弱,2min时的脑放射性摄取率为1.19%ID/g,但脑清除速率较快。以上结果表明,125I标记的二噻吩查尔酮类化合物具备作为Aβ斑块显像剂的潜力,但还需要进一步的修饰以提高初始脑摄取率。

Re/^(99)Tc^m(CO)_3^+黄酮复合物的合成及其与Aβ斑块的结合特性

为研制新型99Tcm(CO)3+标记的黄酮类Aβ显像剂,设计合成了同型Re/99Tcm(CO)3]+-黄酮类衍生物,用荧光法研究了Re(CO)3+-黄酮类衍生物在体外与Aβ斑块的结合特性,并初步观察了其在昆明小鼠体内的生物分布。结果表明,Re(CO)3+-黄酮类衍生物的亲和常数(Kd=5.43 nmol/L)比放射性碘标记的黄酮类衍生物高。正常小鼠的动物分布结果表明,2 min内脑初始摄取较高(0.46±0.23%ID/g),且清除较快(120 min时为0.13±0.04%ID/g)。以上结果表明,99Tcm(CO)3+-黄酮类衍生物有进一步研究的价值。

Aβ斑块靶向近红外荧光探针的合成及评价

目的制备近红外荧光探针ZZN-4、ZZN-6,并考察其光学性质及与Aβ1-42聚集体、APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ斑块的结合能力。方法以2-喹啉甲醛及4-(二甲氨基)肉桂醛为原料,通过缩合反应制备探针ZZN-4、ZZN-6,并通过1HNMR、13CNMR、MS确认结构。考察所制备探针的紫外吸收及与蛋白结合前、后荧光性质的变化;通过蛋白结合饱和实验测定探针与Aβ1-42聚集体结合的解离常数(Kd);对APP/PS1转基因小鼠脑切片进行体外荧光染色,考察其与Aβ斑块的结合能力。结果ZZN-4、ZZN-6与Aβ1-42聚集体结合后,荧光最大发射波长均发生蓝移(分别为635、629nm),但仍处于近红外区;荧光强度分别增强52.4、15.9倍;其中,ZZN-4与Aβ1-42聚集体结合的Kd为6.89nmol·L^-1。APP/PS1转基因鼠脑切片的荧光染色结果表明:ZZN-4可与Aβ斑块特异性结合。结论荧光探针ZZN-4在体外表现出对Aβ1-42聚集体的高亲和力,并对脑切片Aβ斑块具有较好的靶向性,有潜力成为阿尔兹海默症患者脑内Aβ斑块的近红外荧光成像剂。

脑内β-淀粉样蛋白斑块近红外荧光探针的研究进展

β-淀粉样蛋白(β-Amyloid,Aβ)作为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的一个重要病理学特征,被认为是实现AD早期诊断的重要靶点。近年来,荧光成像技术,尤其是近红外荧光成像技术(Near-infrared imaging)得到了快速发展。由于其灵敏度高,操作简便,能够避免生物组织自发荧光干扰,已成为体外生物样本分析和小动物活体成像的重要手段。因此,靶向于脑内Aβ斑块的近红外荧光探针,对于AD的临床前研究、组织病理学检查、治疗药物的筛选和小动物模型的构建具有重要的意义。本文主要对基于分子内电荷转移(Intramolecular charge transfer,ICT)机理的近红外Aβ荧光探针进行归纳和总结,分析分子结构对于探针光学性质和生物学性质的影响,为开发新型高灵敏度的近红外Aβ荧光探针提供了思路。

rTg4510转基因小鼠与阿尔茨海默病患者脑内Tau病变特征异同的比较

目的本研究拟为选择rTg4510转基因小鼠用于磷酸化Tau蛋白代谢、AD相关致病机制及药物筛选等研究提供参考和理论依据。方法利用免疫荧光染色通过S396、4G8、IBA1等抗体检测了rTg4510转基因小鼠与AD患者脑内磷酸化Tau蛋白、β淀粉样蛋白(Aβ)斑块和小胶质细胞,利用CaseViewer、IPWIN Application和GraphPad Prism 8软件对三者进行了分析,比较了rTg4510转基因小鼠与AD患者脑内磷酸化Tau蛋白聚集的表达、分布、类型以及小胶质细胞病变、Aβ斑块等特征的异同。结果与AD患者大脑皮质及海马中磷酸化Tau蛋白(S396)的表达显著高于健康对照组的特征相似(P<0.001),rTg4510转基因小鼠大脑皮质及海马中磷酸化Tau蛋白(S396)的表达显著高于野生对照小鼠(P<0.001)。与AD患者大脑皮质中磷酸化Tau蛋白(S396)表达显著高于相同面积内海马区磷酸化Tau蛋白(S396)表达的特征相近(P<0.001),rTg4510转基因小鼠大脑皮质中磷酸化Tau蛋白(S396)表达相对于相同面积内海马区磷酸化Tau蛋白(S396)的表达也有类似趋势。与AD患者相似,rTg4510转基因小鼠脑内过度磷酸化Tau蛋白(S396)聚集均可见type1类型和type2类型。与AD患者相似,rTg4510转基因小鼠脑内小胶质细胞(IBA1)对过度磷酸化Tau蛋白(S396)识别敏感。与AD患者脑内过度磷酸化Tau蛋白(S396)伴随出现Aβ斑块(4G8)异常表达不同的是,rTg4510转基因小鼠脑内过度磷酸化Tau蛋白(S396)未伴随出现Aβ斑块(4G8)异常表达。结论rTg4510转基因小鼠将是用于研究AD相关磷酸化Tau蛋白致病机制和药物研发等方面可用的动物模型。

阿尔茨海默病正电子显像剂^(11)C-PIB的自动化合成

目的:建立简便的全自动化生产正电子放射性示踪药物2-(4'-N-11C-甲胺基苯)-6-羟基苯并噻唑(11C-PIB)的方法,满足临床诊断需要。方法:采用气相法制备11C-CH3I,11C-CH3I通过灼热的三氟磺酸银粉末转换成11C-Triflate-CH3,然后与前体2-(4'-氨基苯基)-6-羟基苯并噻唑在室温发生反应,反应混合液经半制备HPLC分离后再通过Sep-Pak C18分离柱进行固相萃取,并用0.9%无菌氯化钠溶液稀释,最后通过0.22μm的微孔无菌滤膜过滤得到注射液。结果:合成时间从加速器轰击结束开始共35 min,放化产率经过衰减校正后为48.6%(n=25),化学纯度大于97%,放化纯度大于99%。产品的无菌及无热原要求均符合规定。结论:通过计算机远程控制实现了11C-PIB注射液的全自动生产,简化了生产步骤,保证了生产的可行性和重现性,可完全满足临床需要。

Aβ显像剂2-苯基苯并噻唑衍生物的定量构效关系

11C或123I标记的含有给电子基团的2-苯基苯并噻唑衍生物一般具有较高的Aβ斑块亲和性,是一类潜在的Aβ显像剂。本工作以Aβ亲和性参数lgKi为因变量,一些通过G98W结构优化得到的分子结构参数为自变量,对28个2-苯基苯并噻唑衍生物进行了定量构效关系研究,结果表明,Aβ亲和性与化合物的lgP、Vm、lgVm、He和EHOMO呈线性相关,其中脂溶性参数lgP是影响Aβ亲和性的主要因素。

3′-^(125)Ⅰ-BTA-0的直接标记法及其晶体结构

为了研制^(123)Ⅰ标记的、诊断阿尔茨海默病的苯并噻唑类Aβ斑块显像剂,采用直接标记法合成了3′-^(125)Ⅰ-BTA-0,并探索了^(125)Ⅰ直接标记BTA-0的实验条件,最佳条件为:反应时间25 min,pH值约为2.5,反应温度约为60℃,配体最佳用量为0.1 mL 0.6 g/LBTA-0溶液(含50%乙醇),氧化剂H_2O_2的质量浓度为0.4 kg/L。在最佳标记条件下,3′-^(125)I-BTA-0的标记率为72%,放射化学纯度大于95%。通过亲电反应制备了3′-I-BTA-0的单晶,晶体结构测定结果表明,标记物分子中I原子与S原子同侧。

[^(125)I]TZDM的制备

优良的Aβ显像剂必须对Aβ斑块有较高的亲和性,而体外竞争结合实验是筛选Aβ斑块显像剂的有效方法,实验中需要使用放射性配基[125I]TZDM。以对溴苯胺为起始原料,经过四步反应合成了[125I]TZDM的前体化合物Bu3Sn-TZDM,并通过125I进行标记制备了[125I]TZDM,标记率为62.5%。粗产物通过HPLC分离后,获得放射化学纯度大于97%的[125I]TZDM,实际产率为25%。

Tg2576小鼠的行为和病理特征观察

目的针对阿尔茨海默症(AD)研究中常用的具有C57BL/6和SJL杂交背景的Tg2576转基因小鼠,初步探讨长期繁殖可能对该小鼠AD表型产生的影响。方法选取本实验室引进并长期繁育使用的Tg2576小鼠种群,利用Morris水迷宫、免疫组织化学、酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫荧光技术,研究大鼠AD行为和病理表型。结果与对照小鼠相比,长期传代繁育的Tg2576小鼠随着年龄的增长,在水迷宫测试中仍然出现学习记忆能力的显著下降;免疫组织化学结果显示,小鼠脑皮层出现典型的β淀粉样蛋白(Aβ)沉积,且Aβ在脑组织中的含量较野生型小鼠显著升高;免疫荧光分析表明,在皮层Aβ斑块周围出现大量星形胶质细胞聚集的现象。结论长期繁育的Tg2576小鼠仍具有AD小鼠典型的疾病临床和病理特征。

5xFAD转基因小鼠与阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白特征的异同

目的探明5xFAD转基因小鼠与阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者大脑中β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)斑块特征的异同。方法利用免疫荧光染色通过单克隆抗体(4G8)检测了5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中的Aβ斑块,利用CaseViewer和GraphPad Prism 8软件对其脑内Aβ斑块进行定性定量分析,比较5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中Aβ斑块在形态、数量、类型等特征上的异同。结果5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中Aβ斑块特征的主要相同点包括:在两者的大脑皮质和海马区中均可见明显的Aβ斑块;两者均可见弥散型Aβ斑块和致密型Aβ斑块;两者脑内均以直径<15μm的Aβ斑块占比最高;两者脑内相同面积中直径为[45,60)μm及≥60μm Aβ斑块的数量相似;两者脑内均可见明显的淀粉样脑血管病变(cerebral amyloid angiopathy,CAA)。5xFAD转基因小鼠与AD患者大脑中Aβ斑块特征的主要不同点包括:在5xFAD转基因小鼠脑内直径<15μm的Aβ斑块显著少于AD患者脑内相同面积中的Aβ斑块(P<0.001);而直径在[15,30)μm、[30,45)μm的Aβ斑块显著多于AD患者脑内相同面积中的Aβ斑块(P=0.001,P=0.020);此外,在AD患者脑内致密型Aβ斑块中可见有典型日冕结构的Aβ斑块,而5xFAD转基因小鼠脑内未见典型日冕结构的Aβ斑块。结论5xFAD转基因小鼠大脑中Aβ斑块出现的位置、主要形态、相同面积中直径为[45,60)μm及≥60μm以上Aβ斑块数量以及CAA等方面的特征与我国AD患者高度相似,但是在大脑相同面积中直径<15μm、[15,30)μm、[30,45)μm的Aβ斑块数量以及在有无典型日冕结构Aβ斑块等方面的特征与我国AD患者不同,明确以上特征是使用5xFAD转基因小鼠研究我国AD患者相关病变特征的重要前提。

藏药二十五味珊瑚丸对阿尔茨海默症小鼠肠道菌群的调节

目的验证藏药验方二十五味珊瑚丸(25 Coral Pills,CP25)是否可通过肠道菌群的调节治疗阿尔兹海默症(Alzheimer′s Disease,AD)。方法APP/PS1双转基因AD小鼠(transgenic Mice,Mt)和A?;(amyloid-β,Aβ)蛋白诱导的AD小鼠(A?;induced Mice,Mi)各60只,按CP25给药剂量分为3组:CP25-100,CP25-200,CP25-400,剂量分别为100、200、400 mg·kg;体重,灌胃给药8周(每周连续给药5天,间歇2天)。水迷宫法检测小鼠的认知能力,免疫荧光染色检测A?蛋白,16S RNA检测小鼠粪便肠道菌群丰度。结果CP25给药后Mt和Mi小鼠的学习能力得到明显改善,A?斑块无明显减少。口服CP25明显纠正了Mt小鼠紊乱的肠道菌群,其中下调脱乳杆菌属、瘤胃梭菌属和不可培养拟杆菌属,上调硫弧菌属和普雷沃氏菌科。诱导模型Mi小鼠肠道菌群无明显失调现象,CP25给药对部分菌群有上调或下调作用。中高剂量CP25(CP25-200,CP25-400)对肠道菌群的调节强度高于低剂量(CP25-100)。结论CP25口服给药显著改善了AD小鼠的认知能力,肠道菌群的调节是其可能的作用机制。

Re/^(99)Tc^m(CO)_3^+-二苯基二氮烯类化合物Aβ显像剂的制备以及生物评价

合成了二苯基二氮烯类衍生物((E)-2-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯基氨基)乙酸)为配体L,采用[99 Tcm(CO)3(H2O)3]+核心进行放射性标记,得到放化纯度大于95%的标记化合物99 Tcm(CO)3+-L,同时合成了相应的Re(CO)3+-L。放射性自显影结果表明,99 Tcm(CO)3+-L与AD小鼠(TgC57,APP,PS1 12个月)大脑切片中的Aβ斑块特异性结合,并且结合位点与Re(CO)3+-L荧光染色的位点相同。在正常小鼠体内的生物分布结果表明,99 Tcm(CO)3+-L具有相对较低的脑摄取,5min为(0.52±0.11)%ID/g,120min为(0.28±0.04)%ID/g,可知其脑清除较慢。同时进行Re(CO)3+-L化合物的紫外吸收以及荧光光谱分析,确定其在室温下为低电子激发态。以上结果表明,99 Tcm(CO)3+-L有望作为Aβ斑块SPECT显像剂,值得进一步研究。

紫云英苷诱导自噬减轻APP/PS1转基因小鼠皮质内神经元损伤及老年斑沉积

【目的】探讨紫云英苷(AST)对APP/PS1转基因小鼠脑皮质神经元及Aβ斑块的影响。【方法】将24只8月龄雄性APP/PS1转基因小鼠随机分为APP/PS1组、10 mg/kg AST(APP/PS1+AST 10)组、20 mg/kg AST(APP/PS1+AST 20)组、40 mg/kg AST(APP/PS1+AST 40)组,每组各6只。6只同月龄C57BL/6雄性小鼠作为对照组(WT组)。AST药物连续腹腔注射一个月后,采用免疫荧光染色法观察小鼠脑皮质内Aβ斑块沉积情况,尼氏染色法观察皮质内神经元数量及形态变化,免疫荧光多重染色法观察小鼠脑皮质内LC3B、p62分别与NeuN共表达情况。Western blot法检测皮质中NeuN、LC3B及p62蛋白表达情况。【结果】免疫荧光染色法表明,20、40 mg/kg AST均可减少APP/PS1转基因小鼠脑皮质内Aβ斑块沉积(P<0.0001;P<0.0001)。Western blot结果表明,20、40 mg/kg AST均可增加APP/PS1转基因小鼠脑皮质内NeuN蛋白表达量(P=0.0121;P<0.0001)。免疫荧光多重染色结果揭示APP/PS1转基因小鼠脑皮质内LC3B、p62与NeuN均存在共表达现象。Western blot结果表明,AST增加APP/PS1转基因小鼠脑皮质内LC3B表达量(P=0.007,P<0.0001),减少p62表达量(P<0.0001,P<0.0001)。【结论】AST通过激活自噬减轻APP/PS1转基因小鼠脑皮质内神经元损伤及Aβ斑块沉积。

阿尔茨海默病小鼠模型新奇探索能力的行为学研究

目的:探索阿尔茨海默病疾病模型5×FAD转基因小鼠中Aβ淀粉样斑块与小鼠新奇性探索能力的相关性。方法:免疫组化染色检验野生型小鼠和5×FAD小鼠的Aβ病理;利用4~5月龄野生型小鼠与5×FAD小鼠进行三箱社交行为实验。分别记录野生型小鼠、5×FAD小鼠在三箱社交实验新奇性探索阶段与新异小鼠的接触时间、在三箱设备中运动的总路程和时间等。应用GraphPad Prism 5.0统计软件,对野生型小鼠与陌生小鼠1和陌生小鼠2(新异小鼠)分别接触的时间,5×FAD小鼠与陌生小鼠1和陌生小鼠2接触的时间,以及野生型小鼠和5FAD小鼠与陌生小鼠2的接触时间进行unpaired-t检验。结果:5×FAD小鼠大脑皮层大量分布Aβ斑块;野生型小鼠与陌生小鼠1和2的平均接触时间分别为(95.5±27.22)、(264.6±58.38)s,差异有统计学意义(P<0.05)。5×FAD小鼠与陌生小鼠1和2的平均接触时间分别为(91.02±19.49)、(230.2±60.18)s,差异有统计学意义(P<0.05)。野生型小鼠与5×FAD小鼠和陌生小鼠2的=接触时间之间未见差异,P>0.05。野生型小鼠和5×FAD小鼠在三箱设备中的运动路程分别为(10710±1781)mm、(9017±1402)mm,差异无统计学意义(P>0.05)。野生型小鼠与5×FAD小鼠在三箱设备中的运动的平均速度分别为(47.7+5.453)mm、(37.24+4.590)mm/s,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:5×FAD小鼠在4~5月龄已出现严重的Aβ斑块病理,而未引起小鼠的社交新奇探索能力缺陷。

靶向Aβ聚集体的嘧啶及吡啶荧光探针的生物学评价

目的设计并制备具有嘧啶或吡啶结构的荧光探针,并评价探针的光学性能、与Aβ1-42聚集体的亲和力以及入脑行为。方法以2-甲基吡啶或4-甲基嘧啶为起始原料,通过缩合反应合成了化合物Ⅰ~Ⅲ,并通过1HNMR、13CNMR与HRMS确认结构。考察所制备探针与Aβ1-42聚集体混合前后的光学变化;通过体外饱和试验考察其与Aβ1-42聚集体的亲和力;通过APP/PS1鼠脑切片的体外荧光染色考察探针与脑内Aβ斑块的特异结合;通过离体脑成像试验考察化合物Ⅲ在脑部的摄取与清除过程。结果该系列化合物与Aβ1-42聚集体混合后均显示荧光增强,且具有良好的亲和力,并均能够特异性标记APP/PS1转基因小鼠脑切片上的Aβ斑块;其中,化合物Ⅲ能够有效透过血脑屏障,并具有良好的脑内代谢能力。结论该系列化合物可用于特异性荧光标记Aβ1-42聚集体,且进一步修饰嘧啶结构,将有望得到新型脑内Aβ斑块靶向的荧光显像剂。