β淀粉样蛋白25-35对BV2细胞TREM2/NF-κB信号通路的影响

目的:探讨不同浓度β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)对小胶质细胞髓样细胞触发受体2(TREM2)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:将BV2细胞随机分为5组,分别加入0、5、10、20、40μmol/L的Aβ25-35,作用24、48 h,镜下观察细胞形态,CCK-8法测定细胞活性,酶联免疫吸附实验(ELISA)测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达,实时荧光反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定NF-κBp65、TREM2 mRNA表达。结果:显微镜下观察干预48 h后Aβ25-35≥10μmol/L细胞成片死亡,干预24 h后,CCK-8检测显示,不同浓度Aβ25-35干预BV2细胞的存活率均>70%,ELISA和RT-PCR检测显示,Aβ25-3520μmol/L和40μmol/L组促炎因子TNF-α和TREM2 mRNA的表达均明显升高,Aβ25-3520μmol/L的NF-κB p65 mRNA表达明显升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Aβ25-35浓度20μmol/L作用24 h,能够激活小胶质细胞发生炎症反应,可能与TREM2/NF-κB信号通路的激活有关。

绿茶多酚对D-半乳糖与Aβ25～35诱导的AD模型小鼠学习记忆障碍的改善作用

目的：建立D-半乳糖与Aβ25～35诱导的AD模型小鼠,观察绿茶多酚对其学习记忆障碍的改善作用.方法：皮下注射D-半乳糖（120 mg/kg,连续给药12 w）,并在第7 w时于侧脑室注射Aβ25～35（4 nmol/L）,建立AD模型小鼠.利用跳台法、水迷宫、避暗法和开场实验评价绿茶多酚对AD模型小鼠学习记忆障碍的改善作用.结果：绿茶多酚明显延长跳台潜伏期,减少跳台错误次数;缩短游出迷宫时间和减少进入盲端的错误次数;减少避暗活动错误次数和延长进入穿梭箱潜伏期;同时,明显增加AD小鼠的探究行为.结论：绿茶多酚对D-半乳糖与Aβ25～35诱导的AD模型小鼠学习记忆障碍具有改善作用.

Aβ1～40、Aβ1～42与Aβ25～35在阿尔茨海默病模型复制中的评价

阿尔茨海默病（ AD ）患者大脑皮质弥散性萎缩，神经元丢失，突触减少，细胞外β淀粉样蛋白（ Aβ）沉积形成老年斑（ SP）和细胞内tau蛋白异常磷酸化导致神经原纤维缠结（ NFT）形成是其特征性病理变化。因此，建立能够较好模拟AD患者行为学及组织病理学方面改变的动物模型是AD研究的重点之一，将有助于推动对AD 发病机制的研究及治疗药物的筛选。目前，在AD的模型复制中，大多集中在模拟AD主要病理特点之一，即 SP 的形成为主，多采用海马注射 Aβ1～42、Aβ1～40与Aβ25～35淀粉样蛋白进行模型复制。在动物实验中，模型是评价实验结果的决定性依据，因此，能够建立合适的AD模型是实验研究的基础。本文对比Aβ1～42、Aβ1～40与Aβ25～35的来源、结构及与AD的特异性关系，分析三种模型各自的特点及其在模型复制中可能存在的差异性。

电针对Aβ_(25～35)所致AD模型大鼠海马cAMP的影响

目的观察电针对β淀粉样蛋白25～35片段(Aβ25～35)所致阿尔茨海默病(Alzheimer's diseases,AD)模型大鼠环磷酸腺苷(cAMP)的影响。方法 12月龄雄性SD大鼠,按随机数字表分为四组,即正常组、假手术组、模型组、电针组,各10只。采用双侧海马一次性注射凝聚态Aβ25～35制备AD大鼠模型,电针组选取双侧肾俞穴、内关穴和大椎穴,接G6805-Ⅱ型电针治疗仪,2 Hz连续波,强度1 mA,通电20 min,每天1次,每周6次,共治疗2周。采用放射免疫法检测各组大鼠海马cAMP的变化。结果模型组大鼠海马cAMP的含量明显降低,与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.01);电针组大鼠海马cAMP含量与模型组比较有显著提高(P<0.05)。结论电针改善AD大鼠学习记忆能力的机制之一可能是通过提高海马cAMP实现的。

黑逍遥散对Aβ2535诱导AD模型大鼠脑组织神经递质及海马病理改变的影响

目的观察黑逍遥散对Aβ25~35诱导阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆能力改善作用、脑组织乙酰胆碱酯酶(AchE)、胆碱乙酰转移酶和(ChAT)、单胺氧化酶(MAO)及海马病理改变的影响,探讨黑逍遥散防治AD的作用及其机制。方法 110只SD大鼠先随机挑选16只为假手术组,余下作为造模组,经过7 d的水迷宫实验,剔除记忆力异常的大鼠。造模组再按随机数字表分为模型组、阳性对照组及黑逍遥散高、中、低剂量组。采用Aβ25~35海马区注射诱发大鼠AD模型;高、中、低剂量组分别按4.25、8.50和17.0 g·kg-1·d-1灌胃给药,阳性对照组给予哈伯因(0.02 mg·kg-1·d-1)灌胃,每组14只,给药时间持续28 d。Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力的变化,最后一次水迷宫后,处死大鼠,收集大鼠海马及血液样本。ELISA法测大鼠脑匀浆AchE、ChAT、MAO活性;HE染色法观察海马病理损伤;电镜观察各组大鼠海马组织超微结构的变化。结果黑逍遥散能改善Aβ25~35所致AD模型大鼠行为学功能,提高学习和记忆能力;降低AD大鼠脑组织AchE和MAO活性、升高ChAT活性(P<0.05);改善Aβ25~35所致AD模型大鼠AD大鼠海马病理损伤。结论黑逍遥散改善AD大鼠学习记忆力、保护AD模型大鼠脑组织结构和功能,这可能与其调节胆碱能和单胺类神经元神经递质有关。

Aβ_(25～35)和人参皂苷Rb1对鼠神经干细胞分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A表达的影响

目的:研究大鼠神经干细胞诱导分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表达以及Aβ25～35和人参皂苷Rb1的调节作用。方法:取新生SD大鼠的海马组织体外培养获得NSCs,诱导第3代的NSCs向神经细胞分化1周后,免疫荧光细胞化学染色检测活化型GSK-3β(pTyr279,216)和蛋白磷酸酯酶-2A(PP2A)的表达及Aβ25～35和人参皂苷Rb1对它们的影响;RT-PCR分析糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、细胞周期依赖性蛋白激酶-5(CDK-5)和蛋白磷酸酯酶-2A(PP2A)的mRNA表达以及Aβ25～35和人参皂苷Rb1的影响。结果:免疫荧光细胞化学染色显示:NSCs诱导分化1周后有活化型GSK-3β(pTyr279,216)和PP2A的表达,Aβ25～35能增强GSK-3β(pTyr279,216)的表达同时抑制PP2A的表达,而人参皂苷Rb1则能逆转Aβ25～35的作用;RT-PCR检测发现:NSCs诱导分化1周后表达GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA,使用Aβ25～35处理后GSK-3β、CDK-5的表达增强而PP2A的表达减弱,用人参皂苷Rb1预处理神经干细胞后Aβ25～35的作用受到抑制。结论:体外培养的神经干细胞分化后表达GSK-3β、CDK-5和PP2A,并受Aβ25～35和人参皂苷Rb1的调节,提示在体外由神经干细胞分化的细胞具备正常神经细胞的蛋白磷酸化调节系统。

刺五加皂苷对Aβ2535诱发PC12细胞毒性及细胞凋亡的保护作用

目的研究刺五加皂苷对Aβ25~35处理PC12细胞毒性及细胞凋亡的保护作用。方法将神经细胞生长因子(NGF)诱导的PC12细胞用10 mol/L Aβ25~35处理,建立体外老年性痴呆模型。采用线粒体琥珀酸脱氢酶活性测定、乳酸脱氢酶(LDH)测定法、丙二醛(MDA)含量检测法、流式细胞仪检测法、Western印迹方法检测活化的Caspase-3蛋白水平。结果 Aβ25~35损伤组与对照组比较噻唑蓝(MTT)代谢率下降,LDH释放量增多(P【0.05或P【0.01),MDA含量增高,细胞凋亡率明显增高,活化的Caspase-3蛋白水平明显增高;刺五加皂苷组可不同程度地保护Aβ25~35的细胞毒性及细胞凋亡。结论刺五加皂苷对Aβ25~35处理PC12细胞毒性及细胞凋亡有较好的保护作用。

知母总皂苷对Aβ2535诱导的PC12细胞Bax表达的影响

目的观察知母总皂苷对Aβ25~35诱导PC12细胞凋亡及凋亡相关基因Bax表达的影响。方法培养PC12细胞,实验分为6组:正常组、模型组、知母低剂量组、知母中剂量组、知母高剂量组、西药组。20μmol/L Aβ25~35作用PC12细胞48 h,诱导其凋亡。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率的变化;采用RT-PCR检测各组细胞中Bax mRNA表达水平的变化;采用Western印迹技术检测各组细胞中Bax蛋白的表达水平的变化。结果和模型组比较,知母总皂苷能显著降低Aβ25~35诱导的凋亡(P<0.05),能显著性降低凋亡基因Bax mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)。结论知母总皂苷能降低Aβ25~35诱导的PC12细胞凋亡率,其机制可能是降Bax mRNA及蛋白表达水平。

Aβ_(25～35)对大鼠海马神经元及小胶质细胞的影响

目的探讨双侧海马注射Aβ25~35不同时间点对大鼠海马神经元及MG的影响。方法雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组(注射Aβ后2、7、15、21 d 4个时间点),双侧海马注射Aβ建立大鼠AD模型。水迷宫法观察大鼠学习记忆能力;硫堇染色观察海马CA1区神经元和胶质细胞;Aβ、CD11b免疫组化染色分别观察Aβ沉积和活化MG。结果与对照组相比,模型组大鼠在第3~5天逃避潜伏期均显著延长,学习记忆能力下降(P<0.05);4个时间点模型组大鼠海马都有神经元缺失,胶质细胞增生,2 d、7 d、15 d组大鼠神经元损伤呈加重趋势,但21 d组神经元损伤较15 d组有减轻趋势(P<0.05);4个时间点模型组大鼠都有Aβ沉积和活化的MG,Aβ沉积量及MG活化自第7天后呈下降趋势(P<0.05)。结论 Aβ可以引起神经元损伤,降低大鼠的学习记忆能力;Aβ可以激活MG,引起MG形态和数量改变,MG可吞噬、清除Aβ;Aβ沉积量和MG活化数量变化呈正相关。

促红细胞生成素对Aβ_(25～35)诱导神经细胞损伤保护作用的体外实验

目的探讨促红细胞生成素(EPO)对β淀粉样肽(Aβ)诱导神经细胞毒性的保护作用。方法取对数生长期的PC12细胞分为3组:空白对照组、模型组、EPO预处理组。细胞培养24h后,EPO预处理组加入终浓度为25U/ml的EPO预处理8h,再与模型组同时加入终浓度为10μmol/LAβ25～35,继续培养48h收集细胞检测指标。采用MTT比色法分析细胞存活率,碘化丙啶(PI)流式细胞仪检测凋亡,免疫组化检测细胞色素C(CytC)和Bcl-2表达。结果 MTT显示EPO处理组细胞存活率明显高于模型组(P<0.05),并且中剂量存活率最高;凋亡率较模型组明显下降(P<0.05);免疫组化显示:EPO处理组Bcl-2阳性表达细胞较Aβ25～35处理组明显增加(P<0.05),而EPO处理组CytC阳性染色细胞较模型组明显减少(P<0.05)。结论 EPO可以提高细胞存活率,降低凋亡率,对Aβ诱导神经细胞毒性起保护作用,其机制主要通过上调Bcl-2的表达,从而抑制CytC释放,阻止细胞凋亡,促进PC12细胞存活。

Aβ25～35海马注射对大鼠海马硫化氢/胱硫醚β-合酶体系的影响

目的观察Aβ25～35海马注射对大鼠海马硫化氢(hydrogensulfide,H2S)/胱硫醚β-合酶(cystathionine-β-syn-thase,CBS)体系产生的影响。方法通过双侧海马内注射Aβ25～35制作大鼠AD模型,对照组双侧海马内注射生理盐水。采用全自动酶标仪测定各组大鼠海马中H2S含量、CBS活性。结果 AD组与生理盐水组比较,海马H2S含量均明显降低(P<0.01),CBS活性显著增高(P<0.05)。结论 Aβ25～35海马注射可导致大鼠海马H2S水平下降,CBS表达增强,内源性H2S与CBS之间可能存在负反馈调节作用。

黑逍遥散含药血清对Aβ_(25～35)诱导阿尔茨海默病细胞模型的影响

目的观察黑逍遥散含药血清对由Aβ25~35片段毒性诱导的PC12细胞阿尔茨海默病(AD)模型凋亡的影响。方法利用细胞计数、MTT及流式细胞术测定观察黑逍遥散含药血清处理由Aβ片段诱导的PC12细胞活力、形态学及细胞凋亡的改变。结果黑逍遥散含药血清能增加Aβ25~35导致的升高PC12细胞的活力,降低LDH释放,流式细胞术分析显示,黑逍遥散含药血清能降低增加细胞凋亡率。结论黑逍遥散含药血清能升高PC12细胞的活力,降低LDH释放,对Aβ25~35诱导的PC12细胞凋亡有明显的保护作用。

知母皂苷对Aβ_(25-35)引起的巨噬细胞炎症介质释放的抑制作用及信号转导机制

目的观察知母皂苷(SAaB)是否能对抗淀粉样β蛋白片段25-35(Aβ25-35)引起的巨噬细胞炎症介质释放并探讨其信号转导通路的影响。方法小鼠腹腔巨噬细胞培养24 h,加入不同浓度SAaB(10、30和100μmol·L-1)或加入不同的阻断剂(诱导性一氧化氮合酶阻断剂SMT、MEK1的特异性阻断剂PD98059、p38MAPK特异性阻断剂SB203580和PI3K特异性阻断剂LY294002),之后加入Aβ25-35(20μmol·L-1)继续培养。Aβ25-35作用2 h后,采用Westernblot观察巨噬细胞磷酸化Akt/PKB蛋白表达水平的改变。Aβ25-35作用48 h后,取巨噬细胞培养上清液分别测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)的含量变化。结果 PD98059和LY294002均可明显抑制Aβ25-35引起的巨噬细胞TNF-α产生增加和磷酸化Akt/PKB表达明显增加。SMT可完全对抗Aβ25-35引起的NO释放增加。SAaB可明显抑制Aβ25-35引起的TNF-a和NO的产生增加,并呈明显的浓度依赖性。SAaB也可明显抑制Aβ25-35引起磷酸化Akt/PKB表达增加。结论 SAaB能够明显的抑制Aβ25-35引起的巨噬细胞炎症因子释放,这种抑制作用部分通过SAaB抑制Akt/PKB信号转导通路产生。

Aβ_(25-35)对大鼠大脑皮质神经元神经甾体水平的影响

目的研究Aβ25-35对大鼠大脑皮质神经元合成神经甾体的影响。方法采用Aβ25-35(1μmol·L-1)处理原代培养的大鼠大脑皮质神经元,固相萃取结合高效液相色谱-质谱联用法测定细胞培养液中神经甾体的浓度,四甲基偶氮唑(MTT)法检测细胞活性。结果与对照组相比,Aβ25-35处理后神经元存活率降低约50%(P<0.01),胆固醇处理组神经元存活率未见改变(P>0.05),但Aβ+胆固醇组的神经元存活率明显高于Aβ处理组(P<0.01)。与胆固醇组相比,Aβ25-35处理后神经甾体PREG水平略有降低(P>0.05),PROG水平明显下降(P<0.01),AP水平明显增高(P<0.01)。结论神经甾体PREG-PROG-AP代谢通路在Aβ25-35引起的大鼠大脑皮质神经元损伤时发生明显改变,并能部分地对抗Aβ的神经毒性作用。

地黄活性成分梓醇抗Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞凋亡作用

目的探讨地黄活性成分梓醇对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导PC12细胞凋亡的保护作用。方法常规培养PC12细胞,加入不同浓度梓醇,24 h后加20μmol/L Aβ25-35,48 h后观察梓醇的作用,MTT法测定细胞存活率,TUNEL法测定细胞凋亡发生率,半定量RT-PCR检测细胞Bax和Bcl-2 mRNA表达。结果梓醇终浓度1×10-5mol/L和1×10-4mol/L显著提高PC12细胞存活率(P<0.05和P<0.01);1×10-4mol/L显著降低细胞凋亡发生率(P<0.01)。Aβ25-35损伤可引起凋亡相关蛋白BaxmRNA的表达增加,梓醇终浓度5×10-5mol/L和1×10-4mol/L有降低作用(P<0.05和P<0.01);同时Aβ25-35使Bcl-2 mRNA的表达降低,梓醇有提高作用(P<0.05和P<0.01)。结论地黄活性成分梓醇有对抗Aβ25-35损伤引起的PC12细胞凋亡作用。

Aβ_(25-35)诱导PC12细胞内Ca^(2+)浓度升高和自噬发生

目的研究Aβ25-35对PC12细胞内Ca2+浓度和自噬发生的影响。方法培养PC12细胞,分别用0、5、10μmol/L Aβ25-35处理24 h,用MTT法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度,单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色观察自噬泡,共聚焦显微镜检测LC3-Ⅱ表达,透射电镜观察细胞超微结构。结果 5、10μmol/L Aβ25-35处理24 h后,PC12细胞存活率分别为(64.6±2.3)%和(41.3±4.1)%,与对照组相比显著下降(P<0.05),细胞内游离Ca2+浓度升高(P<0.05)。与此同时,随着Aβ25-35浓度升高,显微镜下可见细胞皱缩、变圆,与对照组相比,细胞内MDC阳性颗粒增多,LC3-Ⅱ荧光强度增强(P<0.05),与Aβ25-35呈浓度依赖关系。电镜下可见单(双)层膜样自噬体。结论Aβ25-35诱导PC12细胞发生自噬呈浓度依赖关系,其发生可能与细胞内游离Ca2+浓度升高有关。

姜黄素影响Aβ_(25-35)诱导PC12细胞周期变化与细胞凋亡的可能机制

目的探讨姜黄素(curcum in,Cur)对β-淀粉样肽(25-35)[β-amyloidpeptide-(25-35),Aβ25-35]诱导体外血清饥饿培养的PC12细胞周期异常与凋亡保护作用的可能机制。方法5μmol.L-1Cur预处理同步于G0期的PC12细胞,加入终浓度为25μmol.L-1Aβ25-35处理0～20h,用RT-PCR和Western blot从mRNA及蛋白水平检测p21、CDK4、E2F1、bax的表达。结果与Aβ25-35诱导组比较,Cur保护组p21mRNA和p21蛋白的表达增加;CDK4、E2F1、baxmRNA和CDK4、Bax蛋白的表达降低。结论Cur可能通过上调p21的表达,下调CDK4、E2F1、bax的表达,对Aβ25-35诱导的PC12细胞周期异常与凋亡起保护作用。

孕酮对Aβ_(25-35)诱导的阿尔采末病模型神经元凋亡的影响

目的研究神经甾体孕酮(PROG)对Aβ25-35诱导的AD模型神经元凋亡的影响。方法将原代培养的大鼠皮质神经元分为对照组、模型组及3个浓度PROG处理组。采用四甲基偶氮唑(MTT)法检测细胞存活率,Hoechest 33342核染色法检测神经元凋亡,Western blot检测胞质caspase-3蛋白表达水平。结果与模型组比较,PROG能剂量依赖地对抗Aβ25-35引起的大鼠神经元存活率的降低;且细胞凋亡率及胞质caspase-3表达水平均降低,细胞凋亡率分别为(53.0±4.2)%(P>0.05)、(31.8±2.1)%(P<0.01)和(11.8±1.2)%(P<0.01),caspase-3表达水平分别为(5.80±0.27)(P>0.05)、(4.98±0.48)(P<0.01)和(3.58±0.21)(P<0.01);其中0.1μmol.L-1 PROG处理组的细胞凋亡率及胞质caspase-3表达水平均与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PROG能通过抑制神经元凋亡对抗Aβ诱导的神经元损伤,产生保护作用。