蛋白A亲和层析法纯化抗乙肝核心抗原单克隆抗体

建立从小鼠腹水中纯化抗乙肝核心抗原(HBcAg)单克隆抗体的一步层析法。将含抗HBcAg单克隆抗体的腹水经离心、过滤和缓冲溶液变换预处理后,采用HiTrap rProtein A FF亲和层析柱纯化,并探讨了上样缓冲液的pH值和NaCl浓度,洗脱液的种类、pH值以及体积流量对抗体纯度及回收率的影响,纯化后的单克隆抗体的生物学活性用间接ELISA法测定。结果显示,以pH7.0,20mmol/LPB+3.0mol/LNaCl为上样缓冲液,0.1mol/LGly-HCl为洗脱液,体积流量为5.0ml/min时,抗HBcAg单抗的纯度大于95%,回收率达75%,纯化后的单克隆抗体的生物学活性没有下降。本研究建立了蛋白A亲和层析法纯化抗HBcAg单克隆抗体的方法,其操作简便、快速而且效果良好。

亲和层析介质性能分析及其在单抗纯化中的应用

对6种商品化蛋白A亲和层析介质进行了性能分析,包括动态载量、洗脱条件等,并对含有单抗药物Mab-HS006的实际料液进行了捕获分离,对宿主细胞蛋白及蛋白A的残留进行了分析。结果表明,Prosep Ultra Plus和Mabselect SuRe亲和介质的载量最高,而Protein A Sepharose CL-4B和r-Protein A Sepharose的洗脱条件最温和。一步层析捕获分离Mab-HS006单抗的结果表明,各种介质的纯度均可达90%以上,Prosep Ultra Plus的宿主细胞蛋白残留最高,Mabselect SuRe蛋白A的脱落最低。

大黄鱼血清IgM纯化及其兔抗血清的制备

分别用饱和硫酸铵二次盐析法和蛋白A亲和层析法对健康大黄鱼(Pseudosciaena crocea)血清中的免疫球蛋白(IgM)进行分离纯化,所得产物用SDS-PAGE进行检测。结果表明,蛋白A亲和层析法可以较好地分离到高纯度的大黄鱼血清IgM,产物的电泳胶中只有重链和轻链2个条带;饱和硫酸铵二次盐析法除了有这2个条带,还有很多杂带,而且蛋白A亲和层析法更为简便、快速,因此用蛋白A亲和层析法分离纯化IgM优于饱和硫酸铵二次盐析法;大黄鱼免疫球蛋白重链的分子量在76 kD左右;轻链分子量在28 kD左右。用纯化的大黄鱼IgM免疫实验兔,获得效价高达1∶40 960的兔抗鱼IgM血清。本实验所建立的蛋白A亲和层析法提取大黄鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物,适合在实验室中纯化鱼类IgM。本研究所制备的兔抗大黄鱼IgM血清可为今后的相关研究工作打下基础。

草鱼血清IgM蛋白的纯化及抗血清的制备

采用盐析法、重组蛋白A(HiTrapr Protein A Sepharose)亲和层析法分离纯化草鱼血清中的IgM,并通过SDS-PAGE及Western-blot技术对纯化蛋白的部分特性进行分析比较并制备兔抗IgM抗血清。结果表明:33%硫酸铵溶液可以沉淀血清中大部分蛋白,但电泳条带仍较多,其中含有78kD和28kD的条带,因此仅可作为免疫球蛋白粗提的方法;而rProtein A亲和层析法所提蛋白则仅有上述重链(78kD)和轻链(28kD)。Western-blot显示,鼠抗人Ig抗体可与78kD及28kD条带发生发应。rProtein A亲和法提纯蛋白的纯度较高,但含量较低,条带较淡,仅可作为实验室小量提纯草鱼IgM的有效方法。将提纯的蛋白免疫实验兔后可制得效价高达1:25600的兔抗鱼IgM血清,并测得血清蛋白总量和IgM含量分别为25.87mg和4.5mg,IgM占血清蛋白总量的17.39%。本实验所采用的蛋白A亲和层析法提取草鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物,适合在实验室中纯化鱼类IgM。同时本研究所制备的兔抗草鱼IgM血清也为今后的相关研究工作打下基础。

人重组LIGHT-Fc分子的真核表达及其抗肿瘤活性研究

目的 :构建人LIGHT Fc基因的真核表达质粒 ,并表达获得有较高生物学活性的纯化人LIGHT Fc融合蛋白。方法 :从cDNA文库中PCR扩增LIGHT全长编码基因 ,并导入克隆载体。测序证实后 ,继续用PCR扩增其膜外区cDNA ,用重叠延伸技术(SOE)引入CD137信号肽基因。将SOE产物与hIgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中 ,瞬时转染 2 93T细胞 ,用夹心ELISA检测其表达情况 ,经蛋白A亲和纯化 ,用SDS PAGE检测其纯度与Mr,并以肿瘤细胞为靶细胞 ,检测其生物学活性。结果 :测序证实构建的LIGHT与LIGHT FccDNA阅读框完整 ,连接部位序列正确 ;ELISA和SDS PAGE证实LIGHT Fc融合蛋白的表达与纯度 ;MTT证明人LIGHT Fc蛋白对一些肿瘤细胞系具有生长抑制作用。结论 :获得了有抗肿瘤活性的纯化hLIGHT Fc融合蛋白 ,为探讨LIGHT在免疫自稳调节中的地位、结合相应受体后的动力学与信号转导机制 。

石杉碱甲多克隆抗体纯化方法的研究

目的根据石杉碱甲多克隆抗体的性质,采用不同的方法对其进行纯化及性质鉴定。方法本实验主要采用硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法和Protein A亲和层析法分别对石杉碱甲多克隆抗体进行纯化,并分别对纯化后的抗体纯度、蛋白量和效价进行检测。结果电泳结果示Protein A亲和层析法纯化后仅出现两条色带,无明显杂带,纯度高。饱和硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法和Protein A亲和层析法纯化后的抗体蛋白含量分别为4.67mg·m L^(-1)、6.89mg·m L^(-1)和13.44mg·m L^(-1)。Protein A亲和层析法纯化后抗体的效价大于1∶256000,其性质未发生变化。结论相较于硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法,Protein A亲和层析法纯化石杉碱甲多克隆抗体的纯度、蛋白含量、抗体效价更高,纯化效果更优。

Con A型差异糖蛋白在大鼠肝再生中的作用研究

为研究差异糖蛋白在肝再生中的作用,运用Con A凝集素固相亲和层析、双向电泳和质谱等技术对大鼠再生肝的糖蛋白质组学进行研究,共鉴定出123种蛋白.有117种蛋白具有潜在的N-或O-糖基化位点;差异分析结果表明,共有33种糖蛋白在肝再生中发生有意义表达,其中,有20种蛋白发生上调表达,9种蛋白发生下调表达,4种蛋白发生上/下调表达.IPA分析表明这些差异蛋白主要参与p70S6K信号通路、PI3K/AKT通路,进一步分析发现NR1H4、GNMT、F16P、BGLR、H6PD、ALDH、14-3-3Z、ASSY、CYTB和ACTB与大鼠肝再生相关,这些糖蛋白均含有不同程度潜在的糖基化位点.本研究有助于进一步开展糖链结构解析和糖基化对蛋白功能的影响,以及糖基化蛋白在肝再生中的作用机理研究.

抗重组人组织因子途径抑制物1单抗抑制rhTFPI-1的抗凝作用

目的研制抗重组人组织因子途径抑制物1单克隆抗体(rhTFPI-1 M cAb),了解其对rhTFPI-1抗凝活性的抑制作用。方法将分泌rhTFPI-1 M cAb的杂交瘤细胞注入经降植烷预处理的Balb/C小鼠腹腔中,诱生腹水。腹水先经硫酸铵沉淀处理,再用rprote in A亲和层析柱进一步纯化。对纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE检测和W estern b lot分析。并用发色底物法测定rhTFPI-1 M cAb对rhTFPI-1的活性抑制。结果纯化后的抗rhTFPI-1 M cAb经SDS-PAGE检测,其纯度为98%;W estern b lot分析显示其能特异识别rhTFPI-1抗原。发色底物法检测结果表明,其能有效阻断rhTFPI-1的抗FVIIa/TF活性,M cAb浓度为8 mg/L时FVIIa/TF剩余活性达到86%;但对rhTFPI-1的抗FXa活性作用不明显,M cAb浓度为80 mg/L时FXa的剩余活性为48.4%。结论rhTFPI-1 M cAb可明显抑制rhT-FPI-1活性,阻碍rhTFPI-1对TF/FVIIa的抑制活性。纯化后的rhTFPI-1 M cAb的各项鉴定指标均较为理想,rprote inA亲和层析柱纯化方法简便易行值得推广。

卵形鲳鲹IgM蛋白的纯化和抗血清的制备

为了获得卵形鲳鲹血清免疫球蛋白(Ig M),笔者首先采用硫酸铵二次盐析法对Ig M进行粗提,然后利用蛋白A亲和层析法进行纯化,并以纯化后的Ig M蛋白为抗原,制备该蛋白的多克隆抗体,最后利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Western blot技术检测所获抗血清的效价及效果。结果表明:用饱和硫酸铵二次盐析法提取的蛋白除了重链和轻链2条电泳带外,杂蛋白较多;利用蛋白A亲和层析法可获得纯度较高的Ig M重链和轻链。用纯化的卵形鲳鲹Ig M免疫小鼠,ELISA方法检测获得的多抗血清效价高达1∶25 600。Western blot结果显示,本实验制备的鼠抗卵形鲳鲹Ig M血清可结合显示出目标条带,说明卵形鲳鲹Ig M多克隆抗血清制备成功,为卵形鲳鲹的后续研究工作奠定了基础。

应用亲合层析结合液相色谱串联质谱法发现结核分枝杆菌H37Rv的新的糖蛋白

目的:应用刀豆素A(ConA)亲合层析结合液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)发现结核分枝杆菌H37Rv的新的糖蛋白。方法:收集生长2周的结核菌培养液,经过滤浓缩得到培养滤液蛋白(culture filtrate protein,CFP)。应用ConA亲合层析法纯化CFP中的糖蛋白,经SDS-PAGE电泳结合考马斯亮蓝染色后,对蛋白条带进行胰蛋白酶消化。应用HPLC-MS检测消化后的糖肽结构并与结核菌H37Rv蛋白质数据库进行比对,寻找新的糖蛋白。结果:CFP经ConA亲合层析纯化后的电泳结果显示有数条蛋白条带出现,经筛选相对分子质量26×103蛋白最可能为糖蛋白。酶切消化该蛋白得到的多肽在HPLC-MS上保留时间26.24min处显示有多肽色谱峰,其对应的一级MS图提示该多肽总质量为1467原子质量单位(AMU),二级MS图显示为多个质荷比(m/z)逐级减少为54(一个己糖的分子质量单位为162AMU)的多肽,提示有己糖丢失。同时,MS分析肽链氨基酸序列并证实蛋白的糖基化存在。与结核菌H37Rv蛋白质数据库比对结果提示,结核菌分泌的26×103蛋白为一新的糖蛋白,即铜-锌超氧化物歧化酶。结论:应用ConA亲合层析结合HPLC-MS发现了一个新的结核分枝杆菌糖蛋白。

美洲黑石斑鱼血清IgM纯化及其兔抗血清部分特性

采用蛋白A亲和层析法对健康美洲黑石斑鱼血清中的免疫球蛋白(IgM)进行分离纯化。实验结果表明,蛋白A亲和层析法一步纯化即可得到电泳纯IgM,其重链和轻链的分子量约74.1 ku和26.0 ku。用纯化的黑石斑鱼IgM免疫实验兔,获得效价高达1∶128 000的兔抗黑石斑鱼IgM血清。Western-blot和间接ELISA检测证明,本工作制备的兔抗美洲黑石斑鱼IgM血清具有较高的特异性,为后续的黑石斑鱼免疫学研究奠定了基础。

几种方法纯化小鼠腹水IgG2b类单抗的比较

分别采用硫酸铵-蛋白A亲和层析法、改进后的硫酸铵-蛋白A亲和层析法、辛酸-硫酸铵-蛋白A亲和层析法纯化小鼠腹水IgG2b类抗体。经SDS-PAGE和间接ELISA分析纯化产物的纯度及其活性。结果表明:3种方法纯化后的单抗的免疫活性均未降低;纯化后单抗的亚类为IgG2b;经改进后的硫酸铵-蛋白A亲和层析法纯化制备的IgG2b类抗体纯度可达到87.1%;经辛酸-硫酸铵-蛋白A亲和层析法纯化制备的IgG2b类单克隆抗体纯度可达到100%,是一种制备高纯度小鼠腹水IgG2b类单克隆抗体简便而有效的方法。

埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基融合蛋白的真核表达与纯化

埃博拉病毒糖蛋白与病毒黏附、入侵宿主细胞等过程密切相关,为了更好地研究该糖蛋白与宿主细胞的相互作用,拟通过哺乳动物细胞表达系统,构建GP1亚基Fc标签融合蛋白。经鉴定,成功构建了埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的真核表达载体pFUSE-GP1-hIgG1-Fc2,并利用该载体及293T细胞构建了表达GP1亚基融合蛋白的哺乳动物细胞系。该融合蛋白N端带有IL2分泌信号肽,C端带有人IgG1-Fc2标签,可在293T细胞以分泌表达的方式存在于细胞培养上清中,而后利用Protein A亲和层析进行融合蛋白纯化。经Western Blots鉴定,成功制备GP1-Fc融合蛋白。这不仅为埃博拉病毒糖蛋白的研究提供了技术支撑,也为其他种类蛋白的哺乳动物细胞真核表达纯化提供了新思路。