黄芩苷通过ROS依赖性调节RhoA/ROCK通路保护氯化钴诱导心肌细胞损伤的实验研究

目的:本研究旨在探讨黄芩苷(Baicalin)对氯化钴(CoCl_(2))诱导H9c2心肌细胞缺氧损伤的作用机制。方法:采用CoCl_(2)建立心肌细胞缺氧损伤模型,并分别加入不同浓度的黄芩苷培养。将正常氧培养设置为对照组,CoCl_(2)培养H9c2心肌细胞设置为CoCl_(2)组;Baicalin、Y27632(Rho激酶抑制剂)预处理的H9c2缺氧心肌细胞设置为CoCl_(2)+Baicalin组、CoCl_(2)+Y27632组、CoCl_(2)+Baicalin+Y27632组。通过细胞毒性检测试剂盒(CCK8)检测细胞活性;荧光探针测定细胞中活性氧(ROS)的表达;WST-8检测心肌细胞超氧化歧化酶(SOD)活力;TBA法测定丙二醇(MDA)浓度;同时采用WesternBlot方法分析RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达情况。结果:处理H9c2细胞24 h后,1 000μmol/L的CoCl_(2)和75μmol/L黄芩苷对治疗心肌细胞缺氧损伤具有较好的细胞活力。CoCl_(2)组细胞活性明显低于对照组,加入黄芩苷后可显著提高细胞活性(P<0.05);与对照组相比,CoCl_(2)组心肌细胞可上调ROS、MDA表达,下调SOD活力,升高RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,加入Baicalin后可逆转上诉蛋白的表达水平;与CoCl_(2)组相比,CoCl_(2)+Baicalin可抑制ROS、MDA的表达,上调SOD含量,下调RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,而加入Y27632(Rho激酶抑制剂)后则可显著增强Baicalin带来的保护作用。结论:Baicalin可减轻CoCl_(2)诱导H9c2心肌细胞缺氧损伤的炎症、氧化应激反应,其机制与抑制ROS依赖性RhoA/ROCK通路有关。

生物钟基因BMAL1通过促进ROCK1调控滋养层细胞功能障碍的研究

目的 分析生物钟基因脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白类似蛋白1(BMAL1)对Ras同源物基因组成员A(RhoA)/Rho相关激酶1(ROCK1)信号通路的影响以及对滋养层细胞生物学功能的调控机制。方法 选择滋养层细胞系JEG3细胞,根据转染BMAL1过表达质粒以及添加1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L ROCK1抑制剂Y27632,分为对照组、BMAL1组、BMAL1+1μmol/L Y27632组、BMAL1+2μmol/L Y27632组、BMAL1+5μmol/L Y27632组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BMAL1、RhoA、ROCK1以及上皮-间充质转化(EMT)标记物N-cadherin、Vimentin和转录因子Snail、Slug的mRNA表达水平;Western blot检测蛋白表达水平;CCK8法检测细胞的增殖活力;流式细胞术分别检测细胞周期、凋亡以及胞内活性氧(ROS)水平。结果 JEG3细胞过表达BMAL1后,与对照组相比,ROCK1 mRNA表达显著增加(P<0.01),RhoA mRNA表达增加但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,BMAL1组N-cadherin、Vimentin、Snail的mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。在蛋白水平,BMAL1组ROCK1、RhoA及Snail蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05),Y27632处理可以显著降低Vimentin及Snail蛋白表达(P<0.05)。此外,与对照组相比,BMAL1组细胞活力显著增加(P<0.001),BMAL1+Y27632各浓度组较BMAL1组细胞活力显著降低(P<0.01)。流式细胞术结果显示,与对照组相比,BMAL1组细胞周期由G0/G1期向S+G2/M期转化,细胞总凋亡率有降低趋势但差异无统计学意义(P>0.05),胞内ROS水平显著降低(P<0.01);与BMAL1组相比,BMAL1+1μmol/L Y27632组和BMAL1+2μmol/L Y27632组细胞早期凋亡率及总凋亡率显著增加(P<0.05),BMAL1+1μmol/L Y27632组细胞ROS平均荧光强度增加但差异无统计学意义(P>0.05),BMAL1+2μmol/L Y27632组细胞ROS平均荧光强度较BMAL1组显著增加(P<0.001)。结论 生物钟基因BMAL1通过促进ROCK1表达参与调控滋养层细胞增殖、DNA合成、凋亡及氧化应激水平。

法舒地尔对大鼠脊髓损伤Rho/ROCK2激酶及铁死亡的影响

目的研究法舒地尔(fasudil hydrochloride,Fasudil)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)Rho亚家族蛋白A/相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(Rho/ROCK2)及铁死亡的影响。方法前瞻性研究将12周龄SD成年雄性大鼠36只(225.2~245.5g)按随机数字表法分为三组:Sham组(假手术),SCI组(脊髓损伤),Fasudil组[SCI+法舒地尔10mg/(kg·d)腹腔注射(Rho/ROCK2激酶抑制剂)],各12只。脊髓撞击法制备成年大鼠SCI模型,通过Basso-Beattie-Bresnahan locomotor scale(BBB)评分检测大鼠的运动功能,试剂盒检测脊髓组织中Fe^(2+)及反应性活性氧(ROS)含量,免疫印迹法检测脊髓组织中Rho/ROCK2及铁死亡相关蛋白xCT、GPX4的表达水平。结果与Sham组比较,SCI后大鼠BBB评分显著降低(P<0.05),Fe^(2+)含量(176.7%±31.5%vs.84.2%±11.2%)及ROS含量(162.2%±28.0%vs.95.8%±12.0%)显著增加(P<0.001),SCI后大鼠脊髓组织Rho/ROCK2(0.85±0.13)vs.(0.28±0.039)表达增多,xCT(0.39±0.041)vs.(0.92±0.092)及GPX4(0.36±0.049)vs.(0.84±0.21)表达水平明显减少(P均<0.001);对比SCI组,Fasudil组大鼠BBB评分增多(P<0.05),Fe 2+(127.8±33.1)%及ROS(123.8±27.6)%含量减少(P<0.05),脊髓组织Rho/ROCK2(0.65±0.17)表达减少,xCT(0.64±0.03)及GPX4(0.55±0.11)表达水平增多(P均<0.05)。结论法舒地尔减少了SCI大鼠脊髓组织中RHO/ROCK2激酶,抑制了脊髓组织中的铁死亡,进而改善SCI大鼠的运动功能。

基于ROCK/NOX4信号通路探究刺芒柄花素对2型糖尿病大鼠内质网应激损伤及肾功能的影响

目的基于RAS同源基因家族成员相关激酶(ROCK)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)4信号通路探究刺芒柄花素对2型糖尿病大鼠内质网应激损伤及肾功能的影响。方法SPF级健康8周龄雄性C57BL/6大鼠60只,随机分为5组,各12只,健康组、模型组、刺芒柄花素低、中、高组,除健康组外均建立2型糖尿病大鼠模型,刺芒柄花素低组、刺芒柄花素中组、刺芒柄花素高组分别给予20、40、100 mg/kg刺芒柄花素灌胃,其余组别灌胃等体积生理盐水。采用自动生化分析仪测定肾功能指标。苏木素-伊红(HE)染色与Masson染色观察大鼠肾组织病形态。TUNEL检测肾小管上皮细胞凋亡。免疫组化检测RAS同源基因家族成员(Rho)A、NOX4、ROCK阳性表达。Western印迹检测内质网应激相关蛋白表达。结果HE染色结果显示:健康组肾脏组织结构正常;模型组肾小球有一定程度萎缩,组织结构排列不均匀,并且有肿胀、脱落现象、还存在空泡样变性、鲍曼囊腔扩,而经过刺芒柄花素干预后,上述情况有所改善,且呈现出明显的剂量依赖性。Masson染色结果显示:健康组肾组织正常;模型组肾小球、肾小管基底膜增厚,产生空泡样病变,肾间质胶原纤维沉积明显;在经过刺芒柄花素干预后上述状况明显改善,且呈现出明显的剂量依赖性。健康组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著低于模型组(P<0.05)。模型组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素低组(P<0.05)。刺芒柄花素低组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素中组(P<0.05)。刺芒柄花素中组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素高组(P<0.05)。结论刺芒柄花素可能是通过调控Rho/ROCK/NOX4信号通路抑制了2型糖尿病大鼠内质网应激,改善肾功能,对肾脏起保护作用。

藁本内酯通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善脂多糖诱导小鼠肾足细胞损伤

【目的】探讨藁本内酯对脂多糖(LPS)诱导小鼠肾足细胞损伤的改善作用及机制。【方法】(1)体内实验:将小鼠随机分为空白对照组,LPS诱导组,藁本内酯低、高剂量组及藁本内酯高剂量+pcDNA-NC(RhoA阴性对照)组、藁本内酯高剂量+pcDNA-RhoA(RhoA过表达)组。除空白对照组,其他各组小鼠采用LPS诱导法构建急性肾损伤(AKI)模型。干预结束后,检测小鼠血清中尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平,高碘酸-希夫(PAS)染色法观察小鼠肾脏组织的病理变化,Western Blot法检测肾脏组织中RhoA、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)蛋白的表达。(2)体外实验:将培养的小鼠足细胞MPC5分为空白对照组,LPS诱导组,藁本内酯低、高剂量组,藁本内酯高剂量+pcDNA-NC组,藁本内酯高剂量+pcDNA-RhoA组,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测足细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,鬼笔环肽染色法分析细胞骨架,Western Blot法检测细胞RhoA、ROCK蛋白的表达。【结果】与空白对照组比较,LPS诱导组小鼠血清中BUN和Cr的水平、肾小管损伤评分、RhoA和ROCK蛋白表达水平升高(P<0.05);与LPS诱导组比较,藁本内酯低、高剂量组小鼠血清中BUN和Cr水平、肾小管损伤评分、RhoA和ROCK表达水平降低(P<0.05)。与空白对照组比较,LPS诱导组MPC5细胞增殖活性、F-肌动蛋白荧光强度、RhoA和ROCK的表达降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05);与LPS诱导组比较,藁本内酯低、高剂量组MPC5细胞增殖活性、F-肌动蛋白荧光强度、RhoA和ROCK的表达升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05)。利用过表达RhoA进行回补实验发现,RhoA过表达逆转了藁本内酯对LPS诱导小鼠肾组织和足细胞损伤的缓解作用(P<0.01)。【结论】藁本内酯可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善LPS诱导小鼠肾足细胞损伤。

Rho激酶(ROCK)在糖尿病并发症中的研究

ROCK(Rho-associated protein kinase),即Rho相关蛋白激酶,是Rho/ROCK通路的重要蛋白。ROCK与GTP(guanosine triphosphate)结合蛋白Rho相互作用,通过磷酸化激活多种下游蛋白或核因子,在机体的各项调节功能中起到重要的作用。研究表明,糖尿病患者体内ROCK异常上调,可能是导致糖尿病并发症的重要原因,最终危及患者心血管系统、泌尿系统乃至生殖系统。而对ROCK的深入研究表明,使用ROCK的拮抗剂,如法舒地尔等,可有效抑制ROCK/Rho通路,最终缓解糖尿病并发症。

miR-153-3p靶向下调Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)基因抑制乳腺癌细胞增殖及迁移

目的探究miR-153-3p调节乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭的分子机制。方法利用生物信息学软件检索预测miR-153-3p的候选靶基因;采用双荧光素酶报告实验分析miR-153-3p与候选基因的靶向关系;应用实时荧光定量PCR和Western blot法检测miR-153-3p对MDA-MB-231细胞mRNA和蛋白质表达水平的影响;通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,并以TranswellTM检测细胞的迁移和侵袭能力。结果软件预测显示miR-153-3p与Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)有连续的结合区域;共转染miR-153-3p模拟物(miR-153-3p mimics)与ROCK1野生型报告载体的细胞相对荧光素酶活性降低;转染hsa-miR-153-3p-mimics后,MDA-MB-231细胞的miR-153-3p表达水平显著增高,且ROCK1蛋白的表达量明显降低。与对照组相比,转染组MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力均减弱。结论miR-153-3p通过靶向下调ROCK1的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

Rho相关激酶Rock在心血管疾病中的研究进展

Rho相关的卷曲蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinase,ROCK)是新近发现的与细胞凋亡相关的激酶,在多种细胞中均有表达,ROCK参与调节细胞的多种行为与功能,包括收缩、游走黏附、增殖及调亡。研究表明ROCK与血管再狭窄、心肌损伤、心肌细胞凋亡及心力衰竭等有关联。

Rho激酶抑制剂介导Rho A/ROCK2通路对VaD大鼠海马神经元的保护机制

目的探讨基于腺相关病毒为载体构建的Rho蛋白激酶2(ROCK2)抑制剂对血管性痴呆(VaD)大鼠海马神经元的保护机制。方法SD大鼠40只,随机分为假手术组、模型组、ROCK2干扰剂组(shROCK2)、阴性对照组(空载体shROCK2)。采用双侧颈总动脉永久结扎术制作VaD大鼠模型,将AAV9-ROCK2-shRNA通过脑立体定位术注射至大鼠海马组织,阴性对照组注入等量空载体腺相关病毒。4 w后,采用Morris水迷宫测定大鼠学习、记忆能力,RT-PCR、Western blot检测各组大鼠Rho A/ROCK2通路Rho A、ROCK2、MLC、MLCP的mRNA及蛋白表达水平,电镜观察大鼠海马突触超微结构变化。结果术后4 w,与模型组及阴性对照组比较,ROCK2干扰组大鼠空间学习及记忆能力显著改善,海马中上述4个指标mRNA及其蛋白表达显著减少(P<0.01),且海马组织内突触前后囊泡正常、细胞器更加完整。结论Rho蛋白激酶2抑制剂通过抑制Rho A/ROCK2信号通路降低下游相关蛋白表达,进而起到促进神经轴突再生,减轻VaD大鼠认知功能障碍的作用。

人细支气管上皮细胞的ROCK激酶抑制剂培养体系扩增及气液相模型的建立

背景:人类原代肺脏上皮细胞在体外难以分离培养,表现为组织来源有限、细胞存活率低、增殖速度慢,缺乏上皮细胞表型分化能力等。目的:体外扩增人细支气管上皮细胞,建立其气液相分化模型,用于肺脏上皮细胞功能研究。方法:采用Pronase和DnaseⅠ联合消化法分离人细支气管上皮细胞。利用ROCK激酶抑制剂培养体系对其进行扩增,免疫荧光染色鉴定细胞类型。建立气液相培养模型,扫描电镜、相差显微镜和免疫荧光染色鉴定细胞分化类型。结果与结论:通过ROCK激酶抑制剂培养体系,体外成功培养扩增了人细支气管上皮细胞。扩增细胞经免疫荧光染色鉴定绝大部分都表达基底细胞标记角质蛋白14,提示人细支气管的基底细胞可能是肺脏上皮干细胞的主要亚群。同时,扩增细胞在气液相培养条件下分化成纤毛细胞和无纤毛柱状细胞,表明ROCK激酶抑制剂培养体系扩增的上皮细胞仍然保持干细胞的增殖分化能力,体外气液相培养模型可以促进人细支气管上皮细胞分化。

IA型磷脂酰肌醇3-激酶和其下游分子蛋白激酶在大肠癌中的表达研究

目的探讨IA型磷脂酰肌醇3-激酶和其下游分子蛋白激酶(PI3K/Akt)在大肠癌中的表达情况,为大肠癌基因治疗的研究发现新的靶点。方法将40只小鼠随机分为正常组和大肠癌组,采用细胞免疫荧光标记法对正常组和大肠癌组小鼠的大肠粘膜上皮组织的蛋白免疫荧光标记物进行测定。结果正常组20例正常大肠组织中有5例FI<1.0,阳性表达率为75.0%;大肠癌组20例均FI>1.0,阳性表达率为100.0%,且FI均比正常组高。两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。正常组平均FI=1.1±0.3,大肠癌组平均FI=1.4±0.2,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论在大肠癌的发生发展过程中存在PI3K蛋白的异常表达,IA型磷脂酰肌醇3-激酶和其下游分子蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路在大肠癌癌变过程中有重要作用。

DEC2通过阻断TGF-β/ROCK1信号通路抑制小鼠肾小球内皮细胞转分化和肾纤维化

目的 基于分化型胚胎软骨发育基因2(DEC2)通过转化生长因子β/Rho相关激酶1(TGF-β/ROCK1)信号通路探讨对肾小球内皮细胞转分化的保护机制。方法 将小鼠随机分为假手术组、单侧输尿管梗阻(UUO)组、空载体处理的UUO组和过表达DEC2的UUO组,每组6只。除假手术组外,其余组建立UUO模型。空载体处理的UUO组和过表达DEC2的UUO组,于第0天(UUO后立即)在超声系统的引导下每侧肾脏注射10μL(108个嗜菌斑形成单位[PFU])空载体或DEC2载体。术后14 d处死小鼠,HE染色检测肾组织学病变情况、 Masson染色检测肾纤维化情况,Western blot法检测肾组织DEC2、 α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、 Rho相关激酶1(ROCK1)的蛋白表达。正常人肾小球内皮细胞(GEnC),采用ROCK1抑制剂Y-27632处理或转染DEC2, Western blot法检测暴露于TGF-β的GEnC中ROCK1、 α-SMA、 DEC2、 E-cadherin表达影响。通过免疫荧光细胞化学染色检测GEnC中ROCK1和DEC2定位,并通过免疫共沉淀实验验证二者的相互作用关系。结果 与假手术组相比,UUO组在第14天出现显著的肾纤维化和胶原蛋白积聚。在UUO组中,小鼠肾组织中DEC2和E-cadherin的表达显著降低,α-SMA的表达显著增加。与空载体处理的UUO组相比,过表达DEC2的UUO组小鼠肾纤维化和胶原蛋白积聚程度降低,并且小鼠肾组织中ROCK1、 α-SMA表达降低和DEC2、 E-cadherin表达增加。TGF-β以时间依赖性方式增强GEnC中ROCK1和α-SMA表达,并且DEC2、 E-cadherin水平降低。用ROCK1抑制剂Y-27632处理可部分消除TGF-β诱导的ROCK1、 α-SMA表达增加和DEC2、 E-cadherin表达降低。此外,在TGF-β刺激前,将GEnC转染DEC2降低细胞中ROCK1、 α-SMA表达,并增加DEC2、 E-cadherin表达。免疫荧光染色显示DEC2在GEnC中与ROCK1共定位,并且免疫共沉淀结果显示DEC2与ROCK1相互拉低。结论 DEC2在纤维化肾组织中下调,上调DEC2通过阻断TGF-β/ROCK1信号通路抑制GEnC的上皮肌纤维母细胞转分化及肾纤维化。

敲低ROCK2基因通过促进线粒体融合并抑制其分裂改善AD小鼠认知功能及减轻神经细胞凋亡

目的 探讨敲低Rho相关螺旋卷曲激酶2(ROCK2)基因对淀粉样前体蛋白/早老素1(APP/PS1)双转基因小鼠认知功能的影响及其机制。方法 APP/PS1双转基因小鼠随机分为AD模型组(AD组)、 ROCK2基因敲低组(shROCK2组)、 ROCK2基因敲低对照组(shNC组),同龄野生型C57BL/6小鼠作为野生型对照(WT组)。Morris水迷宫和Y迷宫实验测试小鼠认知功能,尼氏染色检测神经元形态,免疫荧光组织化学染色检测磷酸化动力蛋白相关蛋白1(p-Drp1)和线粒体融合蛋白1(Mfn1)的表达,Western blot法检测海马组织ROCK2、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、 B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、 Bcl2相关蛋白X(BAX)、 p-Drp1、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、视神经萎缩因子1(OPA1)、 Mfn1和Mfn2的蛋白表达。结果 与AD组小鼠相比,shROCK2组小鼠ROCK2表达明显减少;其认知功能明显改善,海马CA3和DG区神经元数量增加,尼氏体染色深;c-caspase-3和BAX表达降低,同时Bcl2表达升高;线粒体分裂相关蛋白p-Drp1和Fis1的表达减少,而线粒体融合相关蛋白OPA1、 Mfn1和Mfn2的表达增加。结论 敲低ROCK2可以显著改善APP/PS1小鼠的认知功能,并抑制神经细胞凋亡,其机制可能与促进线粒体融合并抑制其分裂有关。

酪氨酸激酶下游蛋白基因与肿瘤关系的研究进展

酪氨酸激酶下游蛋白(DOK)在受体酪氨酸激酶介导的信号通路中起着重要的调节作用。DOK蛋白参与细胞生命活动相关的多种信号通路的调节,其表达异常与多种肿瘤的发生和发展密切相关,但具体作用机制尚不完全清楚。研究DOK基因在肿瘤中的表达与意义对肿瘤的诊断和预后有极其重要的价值,也可为表观遗传学治疗恶性肿瘤提供新的方向和依据。

骨髓间充质干细胞基于Rho/ROCK信号通路对膝骨性关节炎模型大鼠软骨细胞凋亡的影响

目的分析骨髓间充质干细胞(BMSCs)基于鼠抗Ras同源基因(Rho)/Rho相关螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路对膝骨性关节炎(KOA)模型大鼠软骨细胞凋亡的影响。方法随机选取30只健康大鼠,其中正常组10只,模型组10只、BMSCs组10只,分别进行干预。对比各组软骨组织Mankin评分,检测基质金属蛋白酶(MMP)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-10、凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及RhoA、ROCK蛋白表达水平,分析BMSCs对KOA大鼠软骨细胞凋亡的影响。结果BMSCs组Mankin评分高于正常组、低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。BMSCs组血清MMP-1、TNF-α、Bax、RhoA、ROCK表达水平低于模型组、高于正常组,IL-10、Bcl-2表达水平高于模型组、低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。BMSCs组软骨细胞凋亡指数低于模型组、高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论基于Rho/ROCK信号通路调控BMSCs可改善KOA大鼠膝关节软骨病理状态、抑制炎症反应蔓延、调控Bax、Bcl-2蛋白表达、抑制软骨细胞凋亡,其机制可能与抑制Rho/ROCK信号通路相关,证实BMSCs具有良好的抗软骨细胞凋亡疗效。

下游酪氨酸激酶7在肿瘤发生发展过程中的作用

长期以来下游酪氨酸激酶7(Downstream of tyrosine kinase 7,DOK7)一直被认为与先天性肌无力综合症(Congential myasthenic syndrome,CMS)息息相关,但是近些年的研究表明DOK7还与一些肿瘤表型有着密切的联系,有可能成为特定的肿瘤标志物,而目前在肿瘤领域中与DOK7相关的研究报道还比较少,值得对其进行深入探讨。本文整理了近几年来有关于DOK7与肿瘤发生发展的关联文献并加以总结,为后续研究提供可能的思路与肿瘤治疗策略,同时对DOK7基因的研究具有一定的现实指导意义。

腺病毒介导的RNAi对VaD大鼠脑内NgR/RhoA/ROCK2信号通路的影响

目的探讨基于腺相关病毒为载体构建的Nogo受体(NgR)抑制剂通过NgR/Ras基因家族成员(Rho)A/Rho相关激酶(ROCK)2信号通路改善血管性痴呆(VaD)大鼠学习记忆能力及轴突再生分子机制。方法将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、NgR干扰剂组(腺相关病毒)、阴性对照组(NgR空载体病毒),每组10只。采用双侧颈总动脉永久结扎术法制作VaD大鼠模型,模型成功后,将AAV9-NgR-shRNA通过脑立体定位术注射至大鼠海马组织,阴性对照组注入等量空载体腺相关病毒。4 w后,采用Morris水迷宫测定学习、记忆能力,采用实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)、Western印迹检测各组NgR/RhoA/ROCK2通路NgR、RhoA、ROCK2 mRNA及蛋白表达水平,电镜观察大鼠海马突触超微结构变化。结果术后1 w,模型组、阴性对照组潜伏期时间与跨越平台次数与NgR干扰组比较,差异无统计学意义(P>0.05),与假手术组比较有显著性差异(均P<0.05)。术后4 w,与模型组及阴性对照组比较,NgR干扰组潜伏期显著缩短,跨越平台次数显著增加,海马中NgR、RhoA、ROCK2 mRNA及其蛋白表达显著减少(均P<0.05),且海马组织内突触前后囊泡正常、细胞器更加完整;阴性对照组上述指标与模型组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。结论NgR抑制剂可能通过抑制NgR/RhoA/ROCK2信号通路起到促进神经轴突再生,改善海马突触结构,减轻VaD大鼠认知功能障碍的作用。

芍药苷调控RhoA/ROCK2通路对阿尔茨海默病大鼠认知功能障碍的影响

目的探索芍药苷调控Ras同源基因家族成员(Rho)A/Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)2通路对阿尔茨海默病(AD)大鼠认知功能障碍的影响。方法取SD大鼠随机分为假手术组、模型组、芍药苷(20 mg/kg)组、Rhosin(RhoA抑制剂,40 mg/kg)组、芍药苷(20 mg/kg)+Rhosin(40 mg/kg)组,除假手术组外,向其余各组大鼠海马CA1区注入β-淀粉样蛋白(Aβ)_(1~42)多肽诱导建立AD模型,以药物分组干预后,通过Morris水迷宫实验测定各组大鼠逃避潜伏期,以评测其认知功能;通过苏木素-伊红(HE)染色检测各组大鼠海马组织病理形态变化;通过试剂盒检测海马组织超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量及血清致炎因子白细胞介素(IL)-6和干扰素(IFN)_(-γ)含量;通过Western印迹实验检测各组海马组织RhoA/ROCK2通路蛋白RhoA、ROCK2的表达水平。结果与假手术组相比,模型组神经元细胞结构萎缩,变性死亡,排列紊乱疏松,数目明显减少,海马组织呈现明显损伤,海马组织SOD含量显著降低(P<0.05),逃避潜伏期、海马组织ROS及MDA含量、血清IL-6和IFN_(-γ)含量、海马组织RhoA及ROCK2蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,药物干预组海马组织病理损伤均减轻,海马组织SOD含量均显著升高(P<0.05),逃避潜伏期、海马组织ROS及MDA含量、血清IL-6和IFN_(-γ)含量、海马组织RhoA及ROCK2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与芍药苷组、Rhosin组分别相比,芍药苷+Rhosin组大鼠海马组织病理损伤均减轻,海马组织SOD含量均显著升高(P<0.05),逃避潜伏期、海马组织ROS及MDA含量、血清IL-6和IFN_(-γ)含量、海马组织RhoA及ROCK2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论芍药苷可能通过抑制RhoA/ROCK2通路激活,减弱AD大鼠氧化应激与炎症反应,缓解其海马组织病理损伤,提高大鼠学习记忆能力,改善其认知功能障碍。

MiR-28-5p靶向DOK4对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响

目的探讨微小RNA(miR)-28-5p通过靶向酪氨酸激酶下游蛋白4(DOK4)对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的调控作用。方法下载癌症基因组图谱(TCGA)口腔癌数据库,分析miR-28-5p、DOK4与口腔鳞状细胞癌临床表型的关系;转染miR-28-5p模拟物(mimics)、miR-28-5p抑制剂(inhibitor)及对照物(NC)、pcDNA3.1-DOK4及空载体(Vector)、DOK4干扰序列(siDOK4)。CCK-8法和克隆集落形成实验检测口腔鳞状细胞癌的细胞增殖能力;检测各组细胞的抗氧化能力和细胞活性氧(ROS)含量;双荧光素酶报告基因实验验证miR-28-5p与DOK4的靶向关系;观察DOK4过表达对细胞增殖和口腔鳞状细胞癌裸鼠移植瘤生长的影响。结果生物信息学分析显示,相较于癌旁口腔组织,miR-28-5p在口腔鳞状细胞癌组织中表达上调,DOK4 mRNA下调(P<0.05);临床分期Ⅳ期、M 1期、G 3~G 4分级患者miR-28-5p水平高于临床分期Ⅰ~Ⅲ期、M 0期、G 1~G 2分级者(P<0.05);临床分期Ⅳ期、N 1期、G_(3)~G_(4)分级患者DOK4 mRNA水平低于临床分期Ⅰ~Ⅲ期、N 0期、G_(1)~G_(2)分级者(P<0.05);DOK4高表达组无进展生存期和总生存期均高于DOK4低表达组(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-28-5p inhibitor组miR-28-5p水平、细胞活性和集落形成数降低(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-28-5p mimics组DOK4 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05);与Vector组比较,DOK4过表达组细胞和移植瘤组织中DOK4 mRNA和蛋白表达升高,细胞活性、集落形成数、肿瘤体积及重量降低(P<0.05);与miR-28-5p inhibitor组比较,miR-28-5p inhibitor+siDOK4组的DOK4 mRNA和蛋白表达水平降低,细胞增殖活性、集落形成数、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH/NADP+)、谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽(GSH/GSSG)升高,ROS含量降低(P<0.05)。结论miR-28-5p在口腔鳞状细胞癌中表达上调,通过靶向抑制DOK4表达,降低ROS水平,促进细胞增殖。