产气荚膜梭菌Alpha毒素突变体的表达及单克隆抗体制备

[目的]获得产气荚膜梭菌Alpha毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin, CPA)的重组突变体,评价其毒力和抗原性,进而制备针对CPA的单克隆抗体,并评价单克隆抗体特性。[方法]通过人工合成含6个氨基酸突变(第56和130位的天冬氨酸突变为甘氨酸、第275、307和331位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第336位的天冬氨酸突变为天冬酰胺)的CPA基因片段,并将其克隆至pET-30a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达与纯化,获得重组蛋白rCPA_(m6),并检测其毒力与免疫原性。将rCPA_(m6)作为包被抗原建立CPA抗体的间接ELISA检测方法,并用灭活的天然CPA作为免疫原按照常规方法免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,对其功能进行鉴定。[结果]重组蛋白rCPA_(m6)在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中能够以可溶性和包涵体两种形式表达。毒力测定结果显示,100μg/只rCPA_(m6)攻毒后,小鼠全部存活。免疫原性分析结果显示,1×最小致死量(MLD)的天然CPA攻毒后,对照组小鼠全部死亡,10和20μg/只rCPA_(m6)免疫组小鼠存活率为100%。利用rCPA_(m6)成功建立了CPA抗体的间接ELISA检测方法,并筛选获得4株分泌抗CPA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为6E3、6B8、10A11、13D10,且4种细胞上清抗体效价均≥1∶3 200,其中单克隆抗体6B8细胞上清能中和天然CPA,且能与rCPA_(m6)发生反应。[结论]试验成功获得具有良好的安全性和免疫原性的重组蛋白rCPA_(m6),制备的CPA单克隆抗体6B8具有一定的中和活性及较高的特异性和敏感性。研究结果为CPA亚单位疫苗的研制提供了候选抗原,同时为CPA中毒症的治疗以及抗原/抗体检测方法的建立提供了物质基础。

不同宿主来源产气荚膜梭菌生物被膜形成前后药物敏感性分析

为了检测5株不同宿主来源产气荚膜梭菌形成生物被膜能力及其对抗菌药物的敏感性差异,首先用纸片扩散法药敏试验测定5株不同来源的产气荚膜梭菌对7种抗菌药物的敏感性;筛选高敏药物测定各菌株的最小抑菌浓度(MIC);利用结晶紫染色法检测不同来源产气荚膜梭菌生物被膜形成能力和高敏药物对生物被膜的抑制和清除能力。药敏结果显示,5株不同宿主来源产气荚膜梭菌均对氨苄西林高度敏感,对其余6种抗菌药物有不同程度耐药;氨苄西林对不同菌株的MIC值在0.031~2.000μg/mL之间;所有菌株均能生成生物被膜,但生物被膜生成能力有差异;不同菌株在各自4、2、1 MIC下生物被膜的生成受到不同程度抑制,而亚抑菌浓度的氨苄西林能刺激生物被膜的生成,氨苄西林对已经生成的生物被膜不能完全清除。结果表明,不同来源产气荚膜梭菌形成生物被膜前后对药物敏感性不同,可为产气荚膜梭菌的临床用药选择及使用剂量提供一定的参考依据。

鸡源产气荚膜梭菌分离鉴定和药敏试验及枯草芽孢杆菌对其抑制作用

为探究产气荚膜梭菌在黄羽肉鸡重要养殖区域的流行及耐药情况,采集广东、广西等华南地区,安徽、江苏、福建等华东地区6个规模化肉鸡养殖场9份肠道病变样品进行分离鉴定和毒素分型检测、耐药性分析,琼脂扩散试验检测野外分离枯草芽孢杆菌BSGZ7对产气荚膜梭菌的抑菌效果。结果显示,从肠道样品中分离到7株A型和2株G型产气荚膜梭菌,9株分离菌和1株标准菌均对阿莫西林、青霉素、头孢噻肟、氨苄西林、头孢氨苄、氟苯尼考、头孢曲松具有较高的敏感性,对庆大霉素、卡那霉素、四环素、多西环素、链霉素、磺胺异恶唑、林可霉素、红霉素、多黏菌素B等抗菌药物普遍耐药,枯草芽孢杆菌BSGZ7发酵液均对10株菌有抑菌效果。结果表明枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌具有一定抑菌作用,有望成为防控鸡坏死性肠炎的新型绿色安全的抗菌制剂,同时也为临床上鸡坏死性肠炎的防控和治疗提供了参考依据。

1株兔源A型产气荚膜梭菌毒力和免疫原性测定

在兔场中发现一只疑似感染了产气荚膜梭菌病兔,从该兔的病理组织中分离到1株兔源产气荚膜梭菌,对分离株进行血清学分型。毒力以及免疫原性检测。结果表明:该分离株血清型为A型,该分离株肉肝胃酶消化汤培养液的无菌毒素对小鼠和家兔均有毒力、对小白鼠的最小致死量为0.05 m L/只,对家兔的最小致死量为1.5 m L/只。按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(以下简《规程》)方法制备疫苗进行效力检验,免疫保护率不低于80%。

苦参碱对A型产气荚膜梭菌致小鼠肠炎的预防和治疗效果

为研究苦参碱对A型产气荚膜梭菌致小鼠肠炎的预防和治疗效果,本实验将56只8周龄的健康雄性昆明小鼠均分为对照组、菌液组、治疗组和预防组。菌液组小鼠以0.2 mL/只灌胃A型产气荚膜梭菌(1×10~9cfu/mL)16 d,治疗组小鼠于灌胃A型产气荚膜梭菌7 d后灌服苦参碱(30 mg/kg)9 d,预防组小鼠则以A型产气荚膜梭菌菌液和苦参碱同时灌胃16 d,对照组小鼠则每日每只灌服PBS 0.2 mL至16 d。对各组小鼠称重采血后剖杀、收集回肠组织制备病理切片观察组织病变,并分离血清,利用ELISA试剂盒对血清中的炎性细胞因子进行检测,采集肠内容物,经PCR检测后灰度分析A型产气荚膜梭菌的数量,采用ELISA试剂盒测定α毒素含量。结果显示治疗组和预防组小鼠的体质量明显增加;菌液组小鼠肠道小肠绒毛脱落,淋巴细胞和红细胞的数量增加,而预防组和治疗组的肠道炎性细胞浸润减少,肠绒毛结构逐渐恢复,炎症引起的肠组织损伤得以修复。ELISA检测结果显示,预防组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MAPK8的含量与对照组之间无显著性差异(P>0.05);治疗组小鼠血清中IL-6和MAPK8含量显著高于对照组(P<0.05)。PCR检测后灰度分析结果显示,治疗组和预防组小鼠肠内容物A型产气荚膜梭菌的数量与菌液组无显著差异(P>0.05),但与对照组比较,上述两组小鼠释放的A型产气荚膜梭菌α毒素含量明显降低。上述结果表明苦参碱可抑制A型产气荚膜梭菌释放ɑ-毒素,并可恢复小鼠回肠黏膜免疫屏障,降低荚膜梭菌所引起小鼠的肠道炎症。本研究为苦参碱应用于A型产气荚膜梭菌所致肠炎的治疗和预防提供参考依据。

牦牛源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性研究

【目的】2023年4月至2023年5月,西藏拉萨市多地出现牦牛严重腹泻、便血甚至死亡的现象。试验旨在确定牦牛腹泻的病原菌并研究其生物学特性,以期为该地区牦牛腹泻病的防治提供参考。【方法】采集新鲜牦牛腹泻粪便样品进行厌氧培养,通过培养特性及染色镜检进行初步鉴定;对可疑阳性菌株进行生化特性、多重PCR毒素基因分型及cpe、netB、cpb2毒素鉴定,并进行cpa、cpb2、16S rRNA基因的遗传进化分析、部分分离株生长曲线测定及动物致病性试验;采用K-B法测定分离株的体外药物敏感性,统计不同分离株的多重耐药结果。【结果】从样品中分离纯化得到8株分离菌,在厌氧培养基中生长旺盛,在TSC培养基、5%脱纤维绵羊血平板、卵黄琼脂培养基上均呈现与产气荚膜梭菌相似的典型菌落,革兰染色为紫色大杆菌,初步判定为产气荚膜梭菌,命名为XZ-1~XZ-8。分离株生化检测结果与产气荚膜梭菌相符;分离株均携带cpa和cpb2基因,为A型产气荚膜梭菌;16S rRNA基因分析结果显示,8株分离株与产气荚膜梭菌参考株的相似性为97.3%~100%,在系统进化树中处于同一分支,而与屎肠球菌、大肠杆菌参考株处于不同分支;分离株cpa和cpb2基因存在一定的变异性。生长曲线显示,3株分离株(XZ-1、XZ-4、XZ-7)生长规律基本一致,其中0~4 h为迟缓期,4~8 h为对数期,8~22 h为稳定期,22 h后开始进入衰亡期。动物致病性试验结果显示,分离株对昆明小鼠具有较强的致病性。分离株对苯唑西林、红霉素、氯霉素、氧氟沙星、米诺环素、头孢哌酮、利福平及罗红霉素敏感,对青霉素、哌拉西林、羧苄西林、麦迪霉素、头孢曲松等22种药物均存在不同程度的耐药性,存在多重耐药性,其中XZ-7株耐药数量多达11种,6重以上耐药的菌株占75.0%。【结论】本研究成功从拉萨严重腹泻、血便牦牛粪样中分离出8株A型产气荚膜梭菌,分离株对小鼠具有较强的致病性,对青霉素、哌拉西林、羧苄西林等药物存在不同程度的耐药性。研究结果为该地区牦牛腹泻病防控提供了参考依据。

1株猪源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及致病性研究

【目的】探究A型产气荚膜梭菌在仔猪腹泻中的致病性,为A型产气荚膜梭菌感染所致腹泻的诊断和治疗提供理论依据和参考。【方法】通过培养特性和革兰染色镜检对分离菌进行初步鉴定,通过生化试验、毒素基因PCR扩增、16S rRNA序列比对并构建进化树对可疑菌株进一步鉴定,利用药敏试验和动物回归试验研究分离菌株的耐药性和致病性。【结果】分离菌株在TSN平板上呈黑色菌落,在血平板上呈α、β双溶血环,革兰染色呈紫色粗大杆菌。生化试验结果显示,分离菌株葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、还原性硝酸盐试验、H_2S试验和明胶液化均呈阳性,甘露醇、吲哚试验和水杨酸结果呈阴性。16S rRNA序列比对结果显示,分离菌与NCBI数据库中已公布的产气荚膜梭菌16S rRNA基因序列相似性均>99%,鉴定该菌株为产气荚膜梭菌。PCR扩增出plc及cpb2基因,表明该菌株为携带β2毒素的A型产气荚膜梭菌。药敏试验结果显示,分离菌株对青霉素G、庆大霉素、林可霉素、磺胺异噁唑、环丙沙星、诺氟沙星耐药。动物回归试验结果显示,攻菌后仔猪粪便中可检出大量产气荚膜梭菌,该菌株可引起仔猪腹泻,死亡率达50%;死亡仔猪剖检可见小肠充血、出血、鼓气,从脾脏、小肠中可分离出产气荚膜梭菌,且在损伤严重的空肠肠段中分离出高载量A型产气荚膜梭菌。【结论】本试验成功分离出1株A型产气荚膜梭菌,可引起新生仔猪发病,致病性较强,该研究结果为A型产气荚膜梭菌感染仔猪的诊断、流行病学调查、治疗提供了参考依据。

产气荚膜梭菌α-毒素基因数字PCR方法的建立及其在标准物质研制方面的应用

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病原菌,α-毒素是其分子生物学检测的主要靶标。试验选取Clper引物及探针建立微滴式数字PCR(droplet digtial PCR,ddPCR)方法,最佳引物浓度0.85μmol/L,探针浓度为0.3μmol/L,退火温度为60℃。利用建立的ddPCR方法检测单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌的DNA,结果均为阴性,表明该方法具有较好的特异性。合成产气荚膜梭菌α-毒素基因,制成DNA标准品,选取3个稀释梯度的标准品进行重复试验,组内和组间变异系数均小于5%,证明该方法具有较好的重复性。采用7个稀释梯度的标准品进行重复检测,计算出该方法的检测限为12.39 copies/μL,定量限为33.97 copies/μL。通过对68份临床样品进行检测,证实该方法可用于临床,且用于检测质粒DNA时无明显的基质效应。应用ddPCR方法对标准品进行均匀性和稳定性检验,并联合9家实验室进行定值,最终获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书(GBW(E)091237)。α-毒素基因ddPCR方法的建立和DNA标准物的研制,为产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的标准化奠定了基础。

产气荚膜梭菌毒素疫苗研究进展

产气荚膜梭菌是一种引起人类和动物肠道感染和组织坏死的重要食源性病原体,致死因子是其产生的多种外毒素。合理使用抗菌药物及健康养殖需求的增加使疫苗预防更为重要。然而,传统的产气荚膜梭菌外毒素疫苗可能存在效果不稳定及残留毒素和甲醛等问题,引发了人们对这些疫苗安全性的担忧。该文系统介绍了产气荚膜梭菌的传统类毒素疫苗、基因工程重组疫苗及基于反向疫苗学和免疫信息学设计的表位肽疫苗最新研究进展,为研发制备有效、安全的新型产气荚膜梭菌毒素疫苗提供新思路。

鸭肠炎病毒和A型产气荚膜梭菌共感染绿壳蛋鸭十二指肠代谢组学分析

旨在探究鸭肠炎病毒(DEV)和A型产气荚膜梭菌(CpA)共感染绿壳蛋鸭114 h时十二指肠的差异代谢物变化。试验选取12只健康绿壳蛋鸭,随机分为对照组(CK)和共感染组(TCD)。通过临床观察、剖检病理观察以及PCR检测确定DEV和CpA共感染成功,再使用液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测CK组和TCD组感染114 h时鸭十二指肠的代谢物变化,筛选潜在差异代谢物及代谢通路。结果表明,与CK组相比,TCD组鸭十二指肠感染114 h时的总差异代谢物29种,主要有5′-s-甲基-5′-硫腺苷、胞苷、脱氧皮质酮21-葡萄糖苷、腐胺和2-氧吲哚、腐胺、柚皮素、2-氧吲哚、吲哚-3-乙醛等;差异代谢物通过KEGG通路富集分析,共显著富集到22条代谢通路,主要有烟酸酯和烟酰胺代谢、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢、酪氨酸代谢、色氨酸代谢、甘油磷脂代谢等,其中与机体免疫和炎症相关的有腐胺、柚皮素、2-氧吲哚、吲哚-3-乙醛、5′-s-甲基-5′-硫腺苷、烟酸脂和半胱氨酸-蛋氨酸代谢、色氨酸代谢和烟酰胺代谢等。综上所述,DEV和CpA共感染绿壳蛋鸭后,可能通过影响腐胺和柚皮素等代谢物以及色氨酸代谢和半胱氨酸-蛋氨酸代谢通路来影响绿壳蛋鸭十二指肠的炎症,为阐明DEV和CpA共感染机制提供科学依据。

G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及黄羽肉鸡发病模型的建立

为筛选鸡源G型产气荚膜梭菌(Cp)强毒菌株并建立黄羽肉鸡坏死性肠炎(NE)的发病模型,本研究从国内不同地区采集292份鸡肠道及粪便样品,其中健康鸡样品154份,疑似患NE鸡样品138份,经TSC-卵黄平板分离及16S rRNA基因的PCR扩增及测序鉴定,采用多重PCR扩增分离Cp的毒素基因(α、β、ε、ι毒素、肠毒素和坏死性肠炎毒素B(NetB),以确定分离株的毒素分型。结果显示,共获得86株Cp,其中3株从健康鸡样品中获得,83株从患病鸡样品中获得。毒素分型的PCR结果显示,分别出现约900 bp(α毒素)、550 bp(β毒素)、738 bp(NetB毒素)的目的条带;未扩增到ε毒素、ι毒素及肠毒素(506 bp);经统计后结果显示,18株Cp为A型(20.39%),12株为C型(13.95%),56株为G型(65.12%)。选择其中10株生长较好的G型Cp,通过腹腔注射0.2 mL(1×10^(9)cfu/mL)感染小鼠以评估其致病性,结果显示G型Cp分离株CpZZ2、CpDYC1和CpZD1的致病性均较强。将一日龄黄羽肉鸡分成8组,1组~6组为实验组,7组为球虫对照,8组为阴性对照,相应组别黄羽肉鸡于10日龄时经口灌服感染巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)孢子化卵囊,13日龄更换为高蛋白饲料,14日龄分别经口灌服感染G型Cp CpZZ2和CpDYC1株,其中两组鸡连续3 d感染上述两株G型Cp,以构建鸡NE发病模型。在17 d的观察期内统计各组肉鸡的存活率、相对增重率。同时剖杀所有鸡,根据肠道病变评分标准评价各组鸡的肠道病变,筛选致鸡NE的最佳组合。结果显示,通过上述标准判定使用巨型艾美耳球虫(1×10^(9)个孢子化卵囊)+高蛋白饲料(蛋白含量35%)+梭菌(CpZZ2)组的鸡急性NE发病模型成功构建,该组鸡因NE引起的死亡率可达50%,剖检后该组鸡肠道出现充气增粗、肠道内容物为红褐色豆腐渣样物等NE典型病变,而高蛋白饲料+Cp(CpZZ2)组及连续感染Cp组鸡虽不致死鸡,但该两组鸡小肠肠道也出现NE相关病变,可能为亚临床感染,其余各组鸡均无死亡和明显临床症状。本研究从临床分离并筛选的G型Cp强毒菌株,联合球虫感染和高蛋白饲料,诱发了黄羽肉鸡的NE,建立了黄羽肉鸡NE的发病模型,为进一步研究我国黄羽肉鸡NE的发病机制及疫苗研发奠定了基础。

绵羊大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的病原分离鉴定

试验旨在对宁夏一绵羊场疑似大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的死亡病例进行确诊并提出相应的防治方案。采用产气荚膜梭菌显色培养基及伊红美蓝固体培养基进行病原分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因序列PCR检测,依据16S rRNA序列构建分离株分子进化树;之后对大肠杆菌分离株毒素因子进行PCR检测,对产气荚膜梭菌分离株进行毒素分型鉴定。结果显示,分离株PCR检测获得了16S rRNA特异性条带;分子进化树结果显示,大肠杆菌分离菌株NXDC001与大肠杆菌在同一分支,产气荚膜梭菌分离菌株NXSJ001与产气荚膜梭菌在同一分支。大肠杆菌分离株检测出毒素因子HPI(irp2)及LEE(eae);产气荚膜梭菌分离株携带毒素因子cpa,证明分离株为A型产气荚膜梭菌。研究表明,试验成功分离鉴定大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌各一株,证明病死羊为大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌混合感染。

G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其在鸡坏死性肠炎发病模型中的应用

目的:探讨不同诱导因素对鸡坏死性肠炎(Necrotic enteritis,NE)的诱发效果,以便建立鸡坏死性肠炎的发病模型。方法:以安徽省某规模化鸡场采集的病鸡肠道样品中分离出的G型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)(CPG-AH5株)为病原菌,分析单独或联合感染毒害艾美耳球虫对在饲喂高蛋白饲料(添加鱼粉)和不饲喂高蛋白饲料条件下,诱发鸡坏死性肠炎的影响。结果:无诱导因素时,1.1×10^(9)CFU/mL剂量下CPG-AH5株感染可造成肠道损伤(平均病变评分为1.5±0.85分);单一诱导因素(鱼粉或球虫)不能有效促进CPG-AH5株的感染,肠道病变与无诱导因素条件下无显著性提高(2.0±1.15、2.4±1.08,P>0.05);多个诱导因素(鱼粉和球虫)联合诱导可有效促进CPG-AH5株的感染,与无诱导因素和单一诱导因素相比肠道病变显著性提高(3.6±0.52,P<0.001)。结论:鱼粉和球虫联合诱导可显著促进G型产气荚膜梭菌的感染,提高肠道病变。本研究建立了一种鸡坏死性肠炎发病模型,有利于对鸡坏死性肠炎发病机制的研究,为疫苗及药物的后续研发和筛选评价提供了新的技术支撑。

A型产气荚膜梭菌Fba重组干酪乳杆菌的构建与表达

为了构建重组乳酸菌,以A型产气荚膜梭菌全基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增出Fba基因并将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上,鉴定正确后,用1.0 mmol·L-1 IPTG诱导表达,最佳诱导表达时间为5 h。表达的目的蛋白纯化后与弗氏佐剂乳化制备抗血清,Western blot分析表明,目的蛋白能与制备的抗血清特异结合,具有很好的反应原性。将正确的Fba基因与pLA乳酸菌载体构建成重组质粒并电转至干酪乳杆菌中,Western blot结果显示,重组的干酪乳杆菌表达的蛋白与抗血清具有良好的反应原性。间接免疫荧光、流式细胞仪检测结果表明,目的蛋白能够展示表达到菌体表面。

C型产气荚膜梭菌α、β_1毒素基因的融合

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出α和β1 毒素基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含αβ1 融合基因表达质粒重组菌株BL2 1 (DE3) (pETXAB1 )。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1含有αβ1 融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的αβ1 融合蛋白能够被α、β1 毒素抗体识别。免疫实验结果表明,αβ1 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9 44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。

C型产气荚膜梭菌β_1、β_2毒素基因的融合

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。

C型产气荚膜梭菌α、β_1、β_2毒素基因融合及免疫原性研究

为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXA1中扩增出0.95 kbα毒素基因,将其连接到经NcoⅠ单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kbβ1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kbα-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol?L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株.

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆、表达及其生物学活性(英文)

应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株 1A8中 ,分别扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用linker (Gly4Ser) 3 基因 ,将VH 和VL 基因连接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中 .经核苷酸序列分析证实 ,VH 和VL 基因及linker基因拼接正确 ,ScFv 1A8基因全长为 72 6bp ,编码2 4 2个氨基酸 ,VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ (A)和轻链κⅣ家簇 .将ScFv 1A8基因克隆至表达载体pHOG2 1中 ,构建了重组质粒pHOG 1A8,然后转化至受体菌XL1 BLUE中 ,得到重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8) .ELISA检测和SDS PAGE分析表明 :经IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8)的胞周质中 .经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE(pHOG 1A8)的蛋白表达产物占菌体可溶性蛋白的 1 2 % ,其相对分子量约为 31kD .ScFv的生物学活性研究表明 ,ScFv蛋白不但具有中和磷脂酶C的活性 。