2020-2021年宁化县家畜A型口蹄疫抗体水平检测与分析

为评估宁化县猪、牛、羊A型口蹄疫疫苗的临床免疫效果,2020-2021年在全县16个乡镇共采集猪血清1161份、牛血清728份、羊血清504份,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行口蹄疫A型免疫抗体水平检测。结果显示:宁化县2020-2021年猪、牛、羊A型口蹄疫免疫抗体合格率分别为87.60%、90.25%、86.31%,均符合我国农业农村部要求的口蹄疫群体免疫合格率标准,表明A型口蹄疫整体免疫效果良好,但仍有个别乡镇免疫抗体水平较低,需要加强免疫,并持续改进免疫程序、免疫技术等,以有效抵御A型口蹄疫病毒的侵袭。

2019-2021年上海市松江区猪A型口蹄疫免疫抗体监测与分析

为摸清松江区2019-2021年猪A型口蹄疫免疫抗体水平,三年共采集有代表性规模场和专业户的猪血清样品1090份,采用ELISA方法进行检测,结果抗体水平合格的样品812份,合格率为74.5%。规模场、专业户的抗体合格率分别为77.6%、70.3%。

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。

A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

为建立动物血清中的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,通过获得的A型口蹄疫病毒VP1融合蛋白与相关单克隆抗体建立了A型口蹄疫病毒抗体竞争化学发光检测试剂盒。该方法能够特异性的定量检测猪、牛、羊血清中的A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的偶蹄类动物病原无交叉反应,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,具有良好的重复性。对该方法的特异性指标和敏感性指标进行了验证,同国产的A型口蹄疫抗体检测试剂盒进行了比较,阳性样品符合率为92.63%,阴性样品符合率为93.98%,总符合率为93.17%。建立的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,特异性高,敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。

山东省奶牛A型口蹄疫免疫抗体检测与分析

应用ELISA方法对山东省内应用了口蹄疫A型灭活疫苗34个奶牛饲养户进行了免疫抗体跟踪监测与分析.结果:对18家养牛户进行了免疫抗体检测,各牛场平均抗体合格率为42.4%,其中抗体合格率最高的奶牛场其合格率只有65%,低的只有12.5%,一免后所有18个奶牛场均未达到免疫合格标准;二免后16个奶牛场平均抗体合格率为69.4%,其中,抗体合格率≧70%的有10个牛场,达到免疫合格标准二次免疫后有62.5%(10/16)的达到免疫合格标准.研究表明对于A型口蹄疫疫苗的免疫,首免后必须进行加强免疫.

A型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA检测方法的初步建立

用纯化的融合蛋白p GEX-6p-1-VP1作为包被抗原,4E12单抗为检测抗体与待检血清竞争固相抗原,建立了单抗竞争ELISA方法来检测口蹄疫A型抗体,并进行了反应条件的优化,确定阴阳临界值。结果表明,抗原最适包被浓度为0.625μg/m L,待检血清稀释度为1∶2,单抗最大稀释度为1∶400,酶标抗体工作浓度为1∶5000,封闭液、待检血清和单抗作用时间分别为60、60、45 min;阴阳性判断抑制率(PI)≥30%为阳性。与液相阻断ELISA检测试剂盒比对,符合率为84.8%。试验表明,建立的单抗竞争ELISA检测方法具有特异性强、稳定性好等优点,可用于口蹄疫A型血清抗体的检测,这为口蹄疫A型免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了技术平台。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测(英文)

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33Ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T-A-vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET-Avp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET-A-vp1的E.coli BL21(DE3)菌后,SDS-PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37℃条件下,IPTG终浓度为0.3mmol/L,诱导表达6h后,VP1蛋白的表达量最大。Western-Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。

A型口蹄疫病毒型特异性抗原的可溶性原核表达及多克隆抗体的制备

目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建可溶性原核表达载体pET-30a-OmpT-AVP1。将该重组质粒转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,以金属离子螯合层析法对可溶性表达的VP1融合蛋白进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA、Western blot和间接免疫荧光法分别对多克隆抗体进行鉴定。结果 SDS-PAGE电泳分析显示pET-30a-OmpT-AVP1重组菌经诱导后表达一Mr约为33 000的VP1融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带。Western blot分析结果显示,VP1蛋白可与豚鼠抗A型口蹄疫病毒阳性血清反应。用纯化VP1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上,具有较高的型特异性,并且可与同型FMDV细胞培养物中的病毒抗原发生反应。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗A型FMDV结构蛋白VP1多克隆抗体,为A型FMDV易感动物的抗体筛查及病原鉴定奠定了基础。

A型口蹄疫病毒VP3基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS-PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化。结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料。

A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达及多克隆抗体的制备

为构建A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术将不同株的A型口蹄疫病毒抗原表位A-A10-61-VP1(第141～160位氨基酸)、A-A10-61-VP1(第200～212位氨基酸)、A22Iraq-VP1(第136～164位氨基酸)串联,在其间引入合适的linker序列,重组得到pET-28a(+)质粒中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。成功构建了A型口蹄疫病毒抗原表位原核表达载体,获得高纯度重组蛋白和含A型口蹄疫病毒抗体的兔抗血清,为A型口蹄疫病毒诊断试剂盒的研发和A型口蹄疫病毒表位多肽疫苗的研究奠定基础。

不同厂家试剂盒检测猪A型口蹄疫抗体的对比试验

为了对不同厂家试剂盒检测猪A型口蹄疫抗体的敏感性及与兰州兽医研究所(以下简称为兰兽研)猪A型抗体试剂盒检测的一致性进行综合比较,试验从湖南省湘潭市某猪场采集血清样本328份(其中母猪血清268份,育肥猪血清60份),使用A、B、C厂家的试剂盒,同时使用兰兽研试剂盒作为对照,按照各厂家试剂盒说明书对所有血清进行猪A型口蹄疫抗体测定及结果判定。结果显示,母猪FMD-A型抗体阳性率数值,试剂盒A>试剂盒C>试剂盒B>兰兽研试剂盒;育肥猪FMD-A型抗体阳性率数值,试剂盒A>兰兽研试剂盒>试剂盒C>试剂盒B;以兰兽研检测结果为参照,FMD-A型抗体阳性符合率数值试剂盒A>试剂盒C>试剂盒B;FMD-A型抗体阴性符合率数值试剂盒B>试剂盒C>试剂盒A。综合三种试剂盒的敏感性和一致性来看,试剂盒A的检测敏感性及与兰兽研的阳性一致性最高,试剂盒C次之;试剂盒B与兰兽研的阴性一致性最高,试剂盒C次之;三种试剂盒的检测敏感性及与兰兽研的一致性相差不大。

沈阳地区A型口蹄疫免疫抗体的监测报告

应用液相阻断ELISA试验方法对沈阳地区应用口蹄疫A型灭活疫苗对5个奶牛场进行了免疫抗体跟踪监测。结果显示,一免后A型口蹄疫抗体免疫合格率只有在14～28d之间能达到保护水平,抗体下降速度较快;二免后14dA型口蹄疫抗体平均合格率达到高峰,为97%,之后缓慢下降,直至二免后90d还能达到保护水平。表明对于A型口蹄疫疫苗的免疫,首免后1个月必须进行加强免疫,达到三次免疫的效果最好,以后4个月免疫1次。

A型口蹄疫单克隆抗体的研究和实验应用

本试验通过8次细胞融合,获得9株杂交瘤细胞,其中2B_2,B_5,B_5D_9三株杂交瘤细胞分泌的抗体,具有较好的中和活力,所有单抗均属IgM类型,经过2年以上-196℃液氮保存,复苏后抗体滴度不减,仍在1: 5 120ELISA滴度以上.

A型口蹄疫病毒VP1基因序列的基因分型研究

为设计A型FMDV基因分型探针建立其3个基因型的数据库,以美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库和英国口蹄疫世界参考实验室(FMDWRL)基因库中所登记的血清A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因序列为研究对象,运用双序列比对和构建系统发育树的方法对未知基因型的VP1序列进行基因分型并比较两种方法的分型结果。结果表明,两种分型方法的分型率均达到92%,分型结果基本一致。运用这两种方法都可实现对A型FMDV VP1序列的基因分型。

抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7。经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb。亚类为IgG1/κ。间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1∶12 800和1∶105。硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L。应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法。该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104TCID50病毒,与O型、Asia1型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8%。本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段。

表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。

A型口蹄疫抗体水平消长规律的研究

本研究将来自锦州地区40头黑白花奶牛,随机分为A、B、C、D四组,每组10头牛,每头奶牛在进行初免前均采集了O-P液和血清,进行病原学检测和母源抗体检测,在每次免疫21天后采血,采用液相阻断ELISA方法,进行免疫效果监测。通过研究发现A、B组免疫合格率达到70%以上,符合国家标准;C、D组免疫保护率能达到100%。本次试验为我们了解掌握A型口蹄疫免疫效果提供了可靠的科学依据,更为口蹄疫免疫程序的进一步优化提供了参考。

大连地区种猪场猪O型与A型口蹄疫抗体水平现状及分析

大连市动物疫病预防控制中心对大连地区26个种猪场猪口蹄疫O型与A型抗体水平进行检测。通过实验,从抗体合格率、抗体效价水平以及抗体效价分布三个角度进行比较分析,更全面的体现现阶段大连地区猪场口蹄疫的免疫抗体水平,结果显示O型口蹄疫抗体水平整体较好,抗体滴度高,而A型口蹄疫的抗体滴度差异较大,整体抗体水平较O型要低。