A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。

A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

为建立动物血清中的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,通过获得的A型口蹄疫病毒VP1融合蛋白与相关单克隆抗体建立了A型口蹄疫病毒抗体竞争化学发光检测试剂盒。该方法能够特异性的定量检测猪、牛、羊血清中的A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的偶蹄类动物病原无交叉反应,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,具有良好的重复性。对该方法的特异性指标和敏感性指标进行了验证,同国产的A型口蹄疫抗体检测试剂盒进行了比较,阳性样品符合率为92.63%,阴性样品符合率为93.98%,总符合率为93.17%。建立的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,特异性高,敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。

A型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA检测方法的初步建立

用纯化的融合蛋白p GEX-6p-1-VP1作为包被抗原,4E12单抗为检测抗体与待检血清竞争固相抗原,建立了单抗竞争ELISA方法来检测口蹄疫A型抗体,并进行了反应条件的优化,确定阴阳临界值。结果表明,抗原最适包被浓度为0.625μg/m L,待检血清稀释度为1∶2,单抗最大稀释度为1∶400,酶标抗体工作浓度为1∶5000,封闭液、待检血清和单抗作用时间分别为60、60、45 min;阴阳性判断抑制率(PI)≥30%为阳性。与液相阻断ELISA检测试剂盒比对,符合率为84.8%。试验表明,建立的单抗竞争ELISA检测方法具有特异性强、稳定性好等优点,可用于口蹄疫A型血清抗体的检测,这为口蹄疫A型免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了技术平台。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测(英文)

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33Ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T-A-vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET-Avp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET-A-vp1的E.coli BL21(DE3)菌后,SDS-PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37℃条件下,IPTG终浓度为0.3mmol/L,诱导表达6h后,VP1蛋白的表达量最大。Western-Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。

A型口蹄疫病毒型特异性抗原的可溶性原核表达及多克隆抗体的制备

目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建可溶性原核表达载体pET-30a-OmpT-AVP1。将该重组质粒转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,以金属离子螯合层析法对可溶性表达的VP1融合蛋白进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA、Western blot和间接免疫荧光法分别对多克隆抗体进行鉴定。结果 SDS-PAGE电泳分析显示pET-30a-OmpT-AVP1重组菌经诱导后表达一Mr约为33 000的VP1融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带。Western blot分析结果显示,VP1蛋白可与豚鼠抗A型口蹄疫病毒阳性血清反应。用纯化VP1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上,具有较高的型特异性,并且可与同型FMDV细胞培养物中的病毒抗原发生反应。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗A型FMDV结构蛋白VP1多克隆抗体,为A型FMDV易感动物的抗体筛查及病原鉴定奠定了基础。

A型口蹄疫病毒VP3基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS-PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化。结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料。

A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达及多克隆抗体的制备

为构建A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术将不同株的A型口蹄疫病毒抗原表位A-A10-61-VP1(第141～160位氨基酸)、A-A10-61-VP1(第200～212位氨基酸)、A22Iraq-VP1(第136～164位氨基酸)串联,在其间引入合适的linker序列,重组得到pET-28a(+)质粒中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。成功构建了A型口蹄疫病毒抗原表位原核表达载体,获得高纯度重组蛋白和含A型口蹄疫病毒抗体的兔抗血清,为A型口蹄疫病毒诊断试剂盒的研发和A型口蹄疫病毒表位多肽疫苗的研究奠定基础。

A型口蹄疫病毒VP1基因序列的基因分型研究

为设计A型FMDV基因分型探针建立其3个基因型的数据库,以美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库和英国口蹄疫世界参考实验室(FMDWRL)基因库中所登记的血清A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因序列为研究对象,运用双序列比对和构建系统发育树的方法对未知基因型的VP1序列进行基因分型并比较两种方法的分型结果。结果表明,两种分型方法的分型率均达到92%,分型结果基本一致。运用这两种方法都可实现对A型FMDV VP1序列的基因分型。

抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7。经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb。亚类为IgG1/κ。间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1∶12 800和1∶105。硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L。应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法。该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104TCID50病毒,与O型、Asia1型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8%。本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段。

表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。

A型口蹄疫病毒1D蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及电子显微镜检测

目的本实验旨在表达出高可溶性的A型口蹄疫病毒1D蛋白,并通过电子显微镜检测,以期望形成纳米样颗粒。方法根据A型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白基因,并进行截短和优化,共132个氨基酸;同时,从结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)中分离得到135个氨基酸的铁蛋白(Fn)基因片段,将A型口蹄疫病毒1D蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒1D蛋白-铁蛋白片段,命名为CcFnt166AS。构建了CcFnt166AS融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDSPAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的CcFnt166AS融合蛋白。重组蛋白通过NiNTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测。结果成功构建9种CcFnt166AS表达载体;9个标签中,MBP与CcFnt166AS蛋白相融合的可溶表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-CcFnt166AS重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-CcFnt166AS形成了纳米样颗粒。结论本实验建立了稳定获得CcFnt166AS重组蛋白质的方法。

A型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了深入了解VP1蛋白的结构和功能,并建立A型口蹄疫(FMD)血清抗体检测方法,试验采用纯化的重组蛋白p ET-32a-VP1免疫Balb/c小鼠,以纯化的重组蛋白p GEX-6p-1-VP1作为检测抗原包被酶标板检测抗体效价。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,其杂交瘤细胞用间接ELISA法进行筛选,获得4株能稳定分泌抗口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为1D10、3D12、4E12和5G7。结果表明:这4株单克隆抗体均为Ig M亚型和κ轻链,单克隆抗体间可能识别同一个表位,或表位重叠性大。4株单克隆抗体均能被A型FMDV阳性血清所阻断,具有特异性,且以单克隆抗体4E12产生的抗体效价最高、稳定性强、亲和力最大,并能与重组蛋白FMDV-A-VP1特异性结合。说明单克隆抗体4E12可作为单克隆抗体竞争ELISA法的竞争抗体用于检测A型FMDV血清抗体。

A型与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒嵌合基因在家蚕杆状病毒载体中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进A型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取A型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因中的VP1和VP3以及亚洲Ⅰ型蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法检测血淋巴中的表达产物,结果显示目的蛋白在感染病毒后108 h的蚕血淋巴中表达量最高,A型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1 024,而亚洲Ⅰ型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为2 048。结果表明A型和亚洲Ⅰ型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。

A型口蹄疫病毒VP1免疫活性肽基因串联片段的化学合成及克隆与表达

A型口蹄疫病毒（FMDV）VP1蛋白的141～160和200～213位氨基酸序列是决定FMDV免疫原性的抗原决定簇片断．人工合成一个免疫活性肽基因的串连片段（20AA－14AA-20AA）、全部选用大肠杆菌偏爱密码子．在5’端带有EcoR1位点和一个起始密码子ATG，在3’端带有BamH1位点和一个终止密码子TGA．利用这两个酶切位点把该基因连接到pWR590质粒上．并筛选高表达的菌株．结果表明该融合蛋白在大肠杆菌JM101中能高表达．经斑点ELISA实验证明．大肠杆菌细胞中表达的融合蛋白有A型FMDV抗原活性．

A型口蹄疫病毒衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及免疫效果分析

为了探索更有效的A型口蹄疫(FMD)表位疫苗,根据已鉴定的A型口蹄疫病毒(FMDV)主要抗原位点,结合基因序列比对分析,选择了A型FMDV流行毒株的主要抗原位点区进行表位蛋白分子的设计表达。所用表位序列包括A/QH/CHA/2013的VP2 70~81位、118~140位,VP1 G-H环131~157位、C末端188~212位,A/WH/CHA/09 VP1 43~48位、VP3 55~72位,以及非结构蛋白3A中的T细胞表位和通用性T细胞表位,构建免疫原蛋白分子命名为ANX2和ANX3,其中ANX2采用了表位序列反向串联的方式进行设计,用大肠杆菌表达免疫原基因,纯化表位蛋白免疫小鼠和猪,分析特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,并对免疫猪进行了攻毒保护试验,评价表位疫苗的保护效果。结果显示,ANX2、ANX3重组蛋白以包涵体表达为主,蛋白大小约为41 ku和39 ku,均能与A型FMDV阳性血清发生特异性反应;免疫小鼠和猪后都能产生抗A型FMDV特异性抗体;用表位蛋白刺激免疫小鼠脾淋巴细胞,细胞因子IFN-γ和IL-4均有明显的升高;攻毒后对猪有一定的保护作用,ANX2的免疫效果略优于ANX3,证明表位序列反向串联更有利于抗原表位的展示,从而增强其免疫效果。本研究为A型FMDV表位疫苗的研究积累了经验。

A型口蹄疫病毒多抗原表位杆状病毒表达载体的构建及表达

为构建A型口蹄疫病毒(FMDV)多抗原表位杆状病毒表达载体,将A型FMDV上5个B细胞表位(VP1140-160aa、VP270-80aa、VP352-67aa、3B29-42aa和3D16-30aa)和4个辅助性T细胞表位(VP1200-213aa、VP420-34aa、3A21-35aa和3D346-370aa)通过人工合成的方法串联起来构建复合多表位基因B。然后将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB。将酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒pFastBac HTB-B转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将PCR鉴定正确的重组杆状病毒质粒利用CellfectinⅡReagent转染至Sf9细胞。通过间接免疫荧光试验和Western-blot检测表达情况。结果显示,能够得到与A型FMDV猪抗阳性血清结合的蛋白,大小约为22.3ku,与预期结果相符。结果表明,成功构建了A型FMDV多抗原表位杆状病毒表达载体,并在昆虫细胞中正确表达,为下一步蛋白纯化奠定了基础。

口蹄疫A型病毒AF/72株标准细胞毒株的研制

用口蹄疫A型病毒AF/72株的第3代乳鼠组织毒,通过乳鼠继续适应3代后,转适BHK-21细胞,获得该毒株的细胞毒AF/72/MF6/BF12,经测定其TCID50为10-8.0/mL;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其他6株口蹄疫A型病毒株比对,同源性均大于85%;经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng/mL,远大于22 ng/mL的国际标准。综合纯净性检验结果、特异性检验结果和146S含量,确定AF/72/MF6/BF12为口蹄疫A型病毒株AF/72的标准细胞毒。

Pt-Pd合金纳米颗粒标记口蹄疫A型病毒抗体检测的免疫层析方法

[目的]为建立一种新型、高灵敏度,可直观与定量分析的快速检测方法,本研究创新使用具有氧化还原酶活性的合金纳米材料,将其作为标记物制备免疫层析试纸。待反应结束,使用TMB显色剂对免疫反应进行级联放大,可以显著提高检测的灵敏度,不仅可直观判断,也可精确定量分析,这为免疫层析技术标志物筛选与敏感性提高开拓了新的思路与方法。[方法]采用超声水浴法,通过抗坏血酸(AA)还原K2Ptcl4和Na2Pdcl4成功出制备Pt-Pd合金纳米颗粒,将其用于标记口蹄疫A型纯化抗原FMDV-146S,作为捕获抗原纳米标记物,再将纯化的A型表达抗原及其抗体(FMDV-146S-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),经条件优化,建立口蹄疫A型病毒抗体Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条检测方法。对该免疫层析检测技术进行方法学考核,检测结果定量分析并建立标准曲线,同时与LPB-ELISA进行结果比对。[结果]该试纸条可在10 min内完成定性和定量检测,定量检测灵敏度为1:28/test,线性范围1:26/test—1:29/test;检测A型FMDV阳性血清,敏感性为98%,检测FMDV阴性血清、O型和Asia 1型的FMDV阳性血清以及其他动物常见病毒病阳性血清,特异性为94.8%;该试纸条重复检测效果良好;与OIE推荐LPB-ELISA法比较,相关性好,相关系数为0.9112。[结论]本研究开拓采用Pt-Pd合金纳米颗粒为标记物建立免疫层析方法,并首次应用于口蹄疫病毒抗体检测,结果证实其具备较高灵敏度,相比胶体金灵敏度可提高24倍,同时具备可操作性与重现性。该研究是快速免疫层析技术的新尝试,为合金类纳米材料应用提供新的思路,未来具有实践应用前景。