A型核纤层蛋白前体与RanBPM相互作用的验证

目的：本实验室前期工作通过酵母双杂交技术初步证明RanBPM是一个与A型核纤层蛋白前体相互作用的蛋白，本研究进一步通过细胞外蛋白沉降实验（GST pull-down analysis）验证其细胞外的相互作用。方法：构建原核表达载体pET-32a-RanBPM，分别进行RanBPM和prelamin A的原核表达，通过GST pull-down实验证明两者在体外的相互作用。结果：成功构建原核表达载体pET-32a-RanBPM，通过GST pull-down实验验证了RanBPM和prelamin A在细胞外有相互作用。结论：RanBPM和prelaminA在细胞外有相互作用。

NARF基因siRNA干扰片段的筛选

目的筛选能有效沉默A型核纤层蛋白前体识别因子(Narf)基因表达的siRNA片段。方法用半定量PCR初步筛选该基因的siRNA干扰片段,用定量PCR和Western blotting进一步检测siRNA的干扰效果。结果筛选到NARF基因的有效干扰片段。结论通过对NARF基因的有效沉默,为该基因功能的相关机制研究奠定基础。

Prelamin A相互作用蛋白Narf的鉴定和表达分析

目的:探讨A型核纤层蛋白前体(prelamin A)在细胞内堆积造成细胞早老的机理,筛选了prelamin A相互作用蛋白并研究其在早老细胞中的表达情况。方法:以prelamin A的C末端区域为诱饵蛋白,采用酵母双杂交方法从人骨骼肌cDNA文库中筛选prelamin A相互作用蛋白。构建了prelamin A识别因子(Narf)与绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-Narf,与红色荧光蛋白-prelamin A融合表达质粒pDsRed-PLA共转染HEK293细胞,激光共聚焦显微观察共定位情况。Western blotting检测Narf在衰老表型HEK293PLA细胞的表达情况。结果:筛选得到包括Narf在内的7个候选相互作用蛋白。Narf与prelamin A能相互作用并共定位于核纤层,在prelamin A过表达的HEK293PLA细胞中Narf表达没有升高。结论:Narf在细胞内与prelamin A相互作用,且表达量不受后者影响。