A型激酶锚定蛋白2基因表达对生长板软骨细胞功能的影响

目的:探讨A型激酶锚定蛋白2(A-kinase anchoring protein 2,AKAP2)基因表达对生长板软骨细胞(growth plate chondrocytes,GPCs)增殖、分化及细胞外基质代谢的影响及作用机制。方法:设计AKAP2过表达和基因敲除质粒转染GPCs对AKAP2进行过表达或干扰,构建AKAP2过表达阴性对照组(Vector组)、AKAP2过表达组(AKAP2 OE组)、AKAP2干扰阴性对照组(si-NC组)、AKAP2干扰组(si-AKAP2组)和AKAP2 OE+U0126组[U0126:细胞外信号调节蛋白激酶1/2 (extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)通路阻滞剂],记录各组GPCs细胞增殖活力及钙盐沉积情况,检测细胞外基质中Ⅱ型胶原α1(collagen typeⅡalpha 1,COL2A1)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅱ型胶原(collagen typeⅡ,COLⅡ)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和性别决定区Y框蛋白9(SRY-related high-mobility group box gene 9,SOX9)以及ERK1/2表达和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)磷酸化水平,并进行统计学分析。结果 :与Vector组相比,AKAP2 OE组细胞内AKAP2、ALP、COL2A1基因表达与AKAP2、PCNA、SOX9、ALP、COLⅡ蛋白表达及48h细胞活力、p-ERK1/2磷酸化水平均升高,橘红色钙结节显著增多,差异均有统计学意义(P<0.05);与si-NC组相比,si-AKAP2组上述相应检测指标均呈降低趋势(P<0.05)。与AKAP2 OE组相比,AKAP2 OE+U0126组ALP、COLⅡA1基因表达和PCNA、SOX9、ALP、COLⅡ蛋白表达及48h细胞活力、p-ERK1/2磷酸化水平均降低,橘红色钙结节减少,差异均有统计学意义(P<0.05);而ERK1/2基因表达均无显著性差异(P>0.05)。结论:AKAP2基因可以通过调控ERK1/2信号通路影响软骨细胞增殖、分化和细胞外基质代谢,并可能进一步改变正常的生长板软骨内成骨模式。

微小RNA-186靶向调控ARAP2表达及对口腔鳞癌细胞侵袭迁移的影响

目的探讨微小RNA-186(miR-186)靶向调控A型激酶锚定蛋白2(ARAP2)表达及对口腔鳞癌(OSCC)细胞侵袭迁移的影响。方法采用实时定量PCR(QPCR)检测OSCC细胞HN13和人口腔黏膜正常上皮细胞HOK的miR-186水平;脂质体法向HN13细胞分别转染miR-186模拟物(Mimics组)、抑制物(Inhibitor组)和对照随机序列(对照组),QPCR检测miR-186水平,活细胞计数CCK-8试剂盒检测增殖能力,Transwell侵袭和迁移实验检测穿膜细胞数,双荧光素酶报告基因实验验证miR-186与ARAP2的靶向关系,Western blotting检测ARAP2的蛋白水平。结果HN13细胞的miR-186水平高于HOK细胞(3.945±0.712 vs.1.049±0.268,P<0.05);与对照组(1.074±0.192)相比,Mimics组的miR-186水平(4.142±0.348)升高,而Inhibitor组(0.124±0.039)降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,Mimics组在24、48 h的细胞增殖活力升高,而Inhibitor组24、48 h的细胞增殖活力降低(P<0.05)。Transwell侵袭实验中对照组、Mimics组和Inhibitor组的穿膜细胞数依次为(22.9±3.1)、(71.5±9.6)和(15.4±2.4)个,迁移实验中依次为(51.2±6.1)、(106.7±12.5)和(36.8±5.6)个,与对照组相比,Mimics组的穿膜细胞数增多,而Inhibitor组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-186可抑制ARAP2野生型3′端非翻译区的相对荧光素酶活性(P<0.05),但对突变型无影响(P>0.05)。与对照组(0.436±0.026)相比,Mimics组的ARAP2水平(0.024±0.013)降低,而Inhibitor组(0.657±0.019)升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-186在OSCC细胞中表达上调,对OSCC细胞的侵袭与迁移起促进作用,可能通过靶向ARAP2来发挥促癌基因,有可能成为OSCC诊断标记物和新型生物治疗的靶点。