A型肉毒神经毒素理化及生物学特性研究

目的探究A型肉毒神经毒素的理化及生物学特性,为A型肉毒神经毒素制品的研制提供依据。方法采用SDS-PAGE、HPLC测定A型肉毒神经毒素的纯度;采用毛细管凝胶电泳分析其在非还原条件及还原条件下各组分的相对分子质量;采用等电点聚焦电泳测定其等电点;对其N-末端氨基酸序列进行测序,并将测序结果与NCBI blast数据库中A型肉毒梭菌Hall株的氨基酸序列作比对,确证其各组分的成分;对A型肉毒毒素复合物及A型肉毒神经毒素进行口服毒性分析,并对3批A型肉毒神经毒素原液和其半成品进行生物学稳定性研究。结果 A型肉毒神经毒素纯度〉99.00%;非还原条件下其相对分子质量约为152 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN,为完整的A型肉毒神经毒素;还原条件下,由相对分子质量约为101 000、N-末端氨基酸序列为ALNDLQINVN的重链和相对分子质量约为101 000、N-末端氨基酸序列为PFVNKQFNYK的轻链组成;等电点为4.91;口服A型肉毒神经毒素的小鼠LD50为1.50×107U/kg,是其复合物的7.9倍;3批A型肉毒神经毒素原液在2~8℃放置28 d生物学活性无下降,平均比活性为2.13×108U/mg,是其复合物的7.1倍;3批半成品在18~26℃放置28 d生物学活性无下降。结论 A型肉毒神经毒素纯度较高,非还原条件下为单链,还原条件下裂解为轻链和重链,其原液及其半成品的生物学稳定性较好。

A型肉毒神经毒素单克隆抗体的制备与化学发光酶免疫检测技术的应用

从A型肉毒神经毒素杂交瘤细胞中提取单抗基因并在哺乳动物系统中表达纯化,制备A型肉毒神经毒素单克隆抗体。应用化学发光酶免疫分析技术(CLEIA),建立A型肉毒神经毒素快速检测方法。通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)检测杂交瘤细胞序列,以含有单抗基因的质粒为模板进行亚克隆,分别构建轻重链的表达质粒并转到JM108克隆菌株中,后通过质粒大抽试剂盒提取转染级质粒,再将质粒转染到哺乳动物细胞CHO中进行表达,最后亲和层析Protein G柱纯化抗体。利用双抗体夹心原理,优化出CLEIA法最佳检测方案。建立A型肉毒神经毒素CLEIA检测方法,并对该分析方法的检测限、专属性、耐用性逐一进行验证。制备了A型肉毒神经毒素单克隆抗体且建立了A型肉毒神经毒素快速检出方法,检测限为0.156 ng/mL;A型肉毒神经毒素与其他型别无交叉反应且其在不同溶剂介质中检测限不受影响,显示出良好的特异性和耐用性。应用该方法证明了100 U衡力^(Ⓡ)注射用A型肉毒毒素成品在0.02 mol/L,pH=7.8磷酸缓冲液中复溶检测效果最佳。本研究制备的A型肉毒神经毒素单克隆抗体和建立的A型肉毒神经毒素CLEIA检测方法具有良好的实用性,为A型肉毒神经毒素的临床检测及质控分析提供另一种思路和方法。

A型肉毒神经毒素双抗体夹心ELISA的建立及验证

目的 建立A型肉毒神经毒素双抗体夹心ELISA快速定量检测方法,并进行验证及初步应用。方法 通过杂交瘤细胞培养技术制备鼠抗A型肉毒神经毒素单克隆抗体,用ELISA及其他免疫学方法测定抗体效价、亚型及理化性质。优化出最佳试验方案,建立定量检测A型肉毒神经毒素的双抗体夹心ELISA,并对该方法的线性及范围、定量限、准确性、精密度(重复性、中间精密度)、专属性和耐用性进行验证。对本公司相关产品进行测试。结果 制备的A型肉毒神经毒素单克隆抗体纯度为88.15%,效价为1∶102 400,重链亚型为IgG1类,轻链为Kappa类;可与A型肉毒神经毒素的重链特异性结合。建立的A型肉毒神经毒素双抗体夹心ELISA在5.000~80.000 ng/mL范围内线性良好(r>0.99);定量限为2.500 ng/mL;准确度介于80%~115%;CV<15%;该方法与破伤风毒素、B、C、D、E和F型肉毒甘油毒素均无交叉;且A型肉毒神经毒素产品复溶后在2~8℃储存3 d,检测结果不受影响。应用该方法检测本公司开发的新型A型肉毒神经毒素产品,结果符合预期。结论 制备了鼠抗A型肉毒神经毒素单克隆抗体,建立了特异性好且灵敏度较高的A型肉毒神经毒素双抗体夹心ELISA,为A型肉毒神经毒素产品质量控制提供参考价值。

A型肉毒毒素和A型肉毒神经毒素的非临床安全性评价

目的分析注射用A型肉毒毒素和注射用A型肉毒神经毒素活性药用成分(active pharmaceutical ingredient,API)的纯度、N-末端氨基酸序列和相对分子质量,并通过多个非临床研究试验,评价两种制品在药理、毒理特性等方面的一致性。方法采用SDS-PAGE法检测注射用A型肉毒毒素(衡力~,Lantox~,以下简称复合物)和注射用A型肉毒神经毒素(Chintox~,以下简称神经毒素)的纯度;对其N-末端氨基酸序列进行测序,并将测序结果与NCBI blast数据库中A型肉毒梭菌Hall株的氨基酸序列比对,确证其各组分的成分;毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)检测其在非还原及还原条件下各组分的相对分子质量;单次肌肉注射、静脉注射、灌胃给予大鼠及单次肌肉注射给予食蟹猴的试验评价复合物和神经毒素的急性毒性;重复肌肉注射给予食蟹猴39周和恢复期12周的药理毒理试验评价复合物和神经毒素的长期毒性;家兔红细胞的体外溶血试验评价两者的溶血性;肌肉注射给予大鼠Ⅰ、Ⅱ段生殖毒性试验评价肉毒毒素的生殖毒性。结果神经毒素组:非还原条件下,神经毒素相对分子质量约152 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN,为完整的A型肉毒神经毒素;还原条件下,由相对分子质量约101 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN的重链和相对分子质量约51 000、N-末端氨基酸序列PFVNKQFNYK的轻链组成;复合物组:非还原条件下,含A型肉毒神经毒素(Mr 152 000)、非毒素非血凝素蛋白(non-toxic non-HA,NTNH)(Mr 136 000)、HA70组分(Mr 57 000、17 000)、HA33组分(Mr 30 000、28 000)和HA17组分(Mr 15 000),还原条件下,则含有重链、轻链、NTNH、HA70、HA33和HA17组分。注射用A型肉毒毒素、注射用A型肉毒神经毒素单次肌肉注射和静脉注射给予大鼠,肌肉注射的最大耐受剂量≥100 U/kg,静脉注射的最大耐受剂量≥30 U/kg;单次肌肉注射给予食蟹猴所产生的急性中毒反应与死亡情况一致,最大耐受剂量均为20 U/kg,近似致死剂量为40 U/kg;反复肌肉注射给予食蟹猴的试验中,未见明显毒性作用剂量(no observed adverse effect level,NOAEL)均为16 U/kg;在体外对家兔红细胞无溶血作用,不引起红细胞凝聚;Ⅰ段生殖毒性试验对雄鼠生育力的NOAEL为4U/kg,对雌鼠生育力的NOAEL为8 U/kg,对孕鼠早期胚胎发育的NOAEL为16 U/kg;Ⅱ段生殖毒性试验对孕鼠的NOAEL为1 U/kg,对胚胎-胎仔毒性和致畸性的NOAEL为16 U/kg。结论注射用A型肉毒毒素和注射用A型肉毒神经毒素在食蟹猴和大鼠的急性毒性、长期毒性等试验中,剂量、动物病理解剖结果一致,进一步说明A型肉毒毒素和A型肉毒神经毒素的药理毒理特性是相同的,且在反复肌肉注射给予食蟹猴的长期毒性试验中发现,A型肉毒神经毒素更不易产生抗体。在神经毒素灌胃试验中半数致死剂量高于复合物,表明其安全性更好。

A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测

目的从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(Bo NT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定。方法根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成Bo NT/A LC序列,克隆至p TIG质粒,转化BL21(DE3)plys S感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经"吸附-洗脱-扩增"程序淘选富集抗体并进行特异性筛选。PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性。结果可溶性表达的Bo NT/A LC占全菌蛋白的36.8%,纯化后蛋白纯度达99%。从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合Bo NT/A LC蛋白。结论该研究得到了两株特异性的Bo NT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗。

抗A型肉毒神经毒素中和抗体间接ELISA的建立

目的建立间接ELISA,检测血清中抗A型肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin type A, BoNT-A)中和抗体。方法以纯化的BoNT-A作为包被抗原,抗BoNT-A兔血清作为一抗,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A, SPA)作为二抗,结合实验设计,建立检测血清中抗BoNT-A中和抗体的间接ELISA,验证该方法的特异性、灵敏度和重复性,并与经典动物中和试验法检测抗BoNT-A中和抗体的结果进行比较。结果①间接ELISA条件的建立与优化,使用2.50μg/mL纯化的BoNT-A抗原包被,4℃过夜;1%明胶作为封闭剂,37℃封闭2 h;确定一抗优化条件:反应条件为1∶5 000稀释,37℃孵育90 min;二抗优化条件:反应条件为1∶10 000稀释,37℃孵育90 min;加入底物37℃显色10 min,加终止液终止后,用酶标仪测定A450 nm值;②经过验证该方法特异性好,所包被抗原与抗伤寒杆菌兔血清、抗破伤风毒素兔血清、抗B型肉毒毒素兔血清、抗E型肉毒毒素兔血清、抗F型肉毒毒素兔血清均无交叉反应;灵敏度高,当抗BoNT-A兔血清按照1∶320 000稀释时,检测结果依然呈阳性;重复性良好,批内重复性验证CV分别为2.62%、1.40%、2.14%,变异系数均小于3%,批间差异无统计学意义(P=0.103,P>0.05);该方法检测抗BoNT-A中和抗体检出限为抗-0.03 LD50/mL,大约是经典动物中和试验法的1/30,显著地提高了检测灵敏度。结论建立了一种可用于检测血清中抗BoNT-A中和抗体的间接ELISA。

A型肉毒杆菌神经毒素重链干预大鼠脊髓损伤后蛋白表达的初步研究

目的:初步观察大鼠脊髓损伤模型基础上局部注射小剂量A型肉毒杆菌神经毒素重链(BoNT/A HC)后对局部蛋白表达谱的影响,为探讨BoNT/A HC干预在体神经损伤后相关蛋白表达及其干预神经再生机制提供实验基础。方法:复制大鼠单侧腰段脊髓损伤模型;采用SDS-PAGE及双向电泳观察不同剂量BoNT/A HC(2μg、4μg、6μg和8μg)对脊髓损伤后局部(包括损伤部位及其近头端部分脊髓组织)蛋白表达谱的干预作用。结果:大鼠单侧腰段脊髓损伤2 d时局部脊髓组织结构明显破坏崩解,损伤波及左侧脊髓灰质及白质;脊髓损伤局部SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色显示,于损伤同时局部一次性注射不同剂量BoNT/A HC后,某些蛋白表达与单纯损伤组相比明显不同,而与正常组基本一致;双向电泳结果进一步显示,损伤局部注射6μg BoNT/A HC后2 d和20 d时,在不同等电点及不同蛋白分子量水平上,有10余种蛋白表达与单纯损伤组明显不同,呈向正常转化的趋势。结论:大鼠脊髓损伤局部注射BoNT/A HC一定时间可影响损伤局部蛋白表达谱的变化,这种变化呈现由损伤造成的蛋白表达变化被转向正常的趋势。

A型肉毒毒素保护性抗原基因的克隆及其结构分析

以文献报道的 A型肉毒神经毒素基因全序列为标准 ,设计并合成一对引物 ,从肉毒梭菌中扩增含保护性抗原表位的肉毒毒素重链 C端 (Bo NTa Hc)基因片段 ,并将扩增产物进行限制性内切酶消化 ,与相同酶处理的克隆测序载体 p Bluescript KS( +)在体外连接 ,构建测序重组质粒 ,进行测序和基因结构分析 .结果 :PCR扩增获得了产物为 12 75 bp大小的 DNA片段 ,测序结果与 DNA数据库对照检索分析证明 ,此基因片段与 Genbank中的 Bo NTa Hc基因的同源性为 99%,可以认为克隆的基因即为 Bo NTa