A型肉毒神经毒素单克隆抗体的制备与化学发光酶免疫检测技术的应用

从A型肉毒神经毒素杂交瘤细胞中提取单抗基因并在哺乳动物系统中表达纯化,制备A型肉毒神经毒素单克隆抗体。应用化学发光酶免疫分析技术(CLEIA),建立A型肉毒神经毒素快速检测方法。通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)检测杂交瘤细胞序列,以含有单抗基因的质粒为模板进行亚克隆,分别构建轻重链的表达质粒并转到JM108克隆菌株中,后通过质粒大抽试剂盒提取转染级质粒,再将质粒转染到哺乳动物细胞CHO中进行表达,最后亲和层析Protein G柱纯化抗体。利用双抗体夹心原理,优化出CLEIA法最佳检测方案。建立A型肉毒神经毒素CLEIA检测方法,并对该分析方法的检测限、专属性、耐用性逐一进行验证。制备了A型肉毒神经毒素单克隆抗体且建立了A型肉毒神经毒素快速检出方法,检测限为0.156 ng/mL;A型肉毒神经毒素与其他型别无交叉反应且其在不同溶剂介质中检测限不受影响,显示出良好的特异性和耐用性。应用该方法证明了100 U衡力^(Ⓡ)注射用A型肉毒毒素成品在0.02 mol/L,pH=7.8磷酸缓冲液中复溶检测效果最佳。本研究制备的A型肉毒神经毒素单克隆抗体和建立的A型肉毒神经毒素CLEIA检测方法具有良好的实用性,为A型肉毒神经毒素的临床检测及质控分析提供另一种思路和方法。

A型肉毒毒素与CGRP单克隆抗体药物治疗慢性偏头痛的研究进展

以往研究表明,A型肉毒毒素可显著降低慢性偏头痛患者的头痛频率、头痛强度和头痛相关的功能障碍。近年来发现靶向降钙素基因相关肽(CGRP)通路的多个单克隆抗体也可以显著改善慢性偏头痛患者的临床转归。目前尚缺乏二者预防性治疗慢性偏头痛的对比研究。本文重点介绍A型肉毒毒素和靶向CGRP及其受体单抗[CGRP(r)mAb]治疗慢性偏头痛的疗效和安全性,及A型肉毒毒素疗效不足的患者转换为CGRP(r)单抗治疗后的转归,为临床治疗选择提供借鉴。

A型肉毒毒素联合脉冲射频治疗带状疱疹后神经痛的疗效及安全性

目的 探讨A型肉毒毒素(BTX-A)联合脉冲射频(PRF)治疗带状疱疹后神经痛(PHN)的疗效及安全性。方法 收集PHN患者共80例。随机分为观察组(B组)和对照组(C组)。B组行BTX-A皮内注射联合PRF治疗,C组行利多卡因皮内注射联合PRF治疗。采用数字疼痛评分(NRS)、简化麦吉尔疼痛问卷(SF-MPQ)和睡眠质量评分(QS)评估患者术前、术后1、3、7 d、术后1、2、3个月的疼痛程度和睡眠质量。收集患者术后的不良反应。检测患者术前与术后3 d血清中的白细胞介素-1β(IL-1β)和降钙素基因相关肽(CGRP)水平。结果 B组和C组在术后各时间点的NRS评分、SF-MPQ评分、QS评分与术前相比均显著下降(P <0.05)。与C组相比,B组在术后1、2、3个月的NRS、SF-MPQ评分评分显著降低(P <0.05);B组在术后2、3个月的QS评分显著降低(P <0.05)。术后3个月B组疼痛缓解的有效率(90%)与C组(56.7%)比较,差异有统计学意义(P <0.05)。两组均未发生严重不良反应。两组患者术后3 d血清中的IL-1β和CGRP含量均较术前显著下降,B组IL-1β和CGRP的下降程度较C组更显著(P <0.05)。结论 BTX-A联合PRF治疗PHN可以有效减轻其疼痛程度、改善睡眠质量,安全性高。

A型肉毒毒素作用于神经胶质细胞缓解神经病理性疼痛机制的研究进展

神经病理性疼痛是一个重要的临床问题,常规药物治疗效果不佳。A型肉毒毒素可缓解多种疼痛,其镇痛作用被认为与神经胶质细胞相关。本文概要介绍A型肉毒毒素作用于神经胶质细胞缓解神经病理性疼痛机制的研究进展,进一步探究A型肉毒毒素在神经病理性疼痛治疗上的临床潜力。

A型肉毒毒素在带状疱疹后遗神经痛中的疗效及作用机制

带状疱疹后遗神经痛(postherpetic neuralgia,PHN)是带状疱疹最常见的并发症,以疱疹部位皮肤烧灼或电击样疼痛为表现,常引起睡眠障碍、焦虑、抑郁等不良结果,严重影响患者的生活质量、身体机能和心理健康,给个人和社会带来相应的医疗和经济负担。随着社会发展,人口老龄化,PHN发病率将逐年增高。肉毒毒素是一种神经毒性蛋白,研究表明,A型肉毒毒素(botulinum toxin-A,BTX-A)能够显著缓解PHN改善患者生活质量,但其作用机制尚未阐明。本文就BTX-A治疗PHN的有效性、安全性及作用机制的研究现状作一阐述,希望为临床医生治疗PHN提供帮助和指导。

抗肉毒神经毒素A(BoNT/A)单克隆抗体的制备与鉴定(英文)

目的 :制备抗肉毒毒素A(BoNT/A)的单克隆抗体 (mAb)。方法 :用纯化的重组BoNT/A Hc片段免疫BALB/c小鼠 ,取其脾细胞与骨髓瘤Sp2 /0融合 ,经间接ELISA筛选和克隆化制备杂交瘤细胞系 ,及Western免疫印迹分析等方法对mAb进行特异性鉴定。结果 :获得 3株杂交瘤细胞株 :命名为4A8、2F7和 4F2 ,IgG亚类鉴定均为IgG1,腹水mAb的效价在 1× 10 -4～ 1× 10 -6之间。其中 ,4A8和 4F2能稳定分泌抗BoNT AmAb,并可特异性地识别重组BoNT/A和天然BoNT/A ,特别是 4A8可保护小鼠抵抗 10LD50 BoNT/A的攻击。结论 :成功地制备 3株特异性抗BoNT/AmAb ,并有 1株属于中和性mAb 。

B型肉毒毒素单克隆抗体杂交瘤株的建立

[目的]制备、筛选稳定分泌B型肉毒毒素单抗的杂交瘤克隆,为相关研究提供工具。[方法]采用纯化的B型肉毒毒素免疫BALB/c小鼠,用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选阳性克隆。[结果]得到10株稳定分泌B型肉毒毒素单抗的杂交瘤克隆,1株为IgM,其余9株分泌IgG,亚类为IgG2a。10株单克隆抗体均与B型肉毒毒素呈特异性反应,而与标准A型肉毒毒素无交叉反应,腹水单抗的效价均在105以上。[结论]10株杂交瘤细胞株均能分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体,为B型肉毒毒素的检测和研究提供了工具。

抗℃型肉毒毒素单克隆抗体的研究

用透析培养法制备的Ｃ型肉毒毒素的类毒素，免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠．取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系ＳＰ２／０融合。经ＨＡＴ选择培养基选择培养，其细胞融合率平均为７４．５％。用间接ＥＬＩＳＡ法筛选后．共获得９４孔产生抗Ｃ型肉毒毒素抗体的杂交瘤阳性孔。选其中１Ｃ２、１Ｄ１２、１Ｅ８、１Ｇ６、１Ｇ１１；、２Ｂ１２、２Ｃ１１、２Ｅ１２、２Ｇ１１、２Ｈ３、３Ａ４、３Ｃ５、３Ｄ３、３Ｆ７、３Ｈ６共１５孔用有限稀释法进行３～５次克隆，阳性克隆率均达１００％。杂交瘤细胞系经过连续传代６个月．仍能稳定地产生ＭｃＡｂ；液氮中冻存１２个月的杂交瘤细胞系经复苏后亦能稳定地产生抗体。应用ＥＬＩＳＡ间接法证明，１５种ＭｃＡｂ均与Ｃ型肉毒毒素呈特异性反应，而与标准Ｂ型肉毒毒素无交叉反应。用ＥＬＩＳＡ间接法测定杂交瘤培养上清液，其抗体效价为１０－２～１０－４，而制备的免疫腹水其效价为１０－５～１０－６。应用所得ＭｃＡｂ（２Ｃ１１、２Ｅ１２、３Ａ４、３Ｄ３）作ＥＬＩＳＡ夹心法检测Ｃ型和Ｂ型肉毒毒素，已显示出该几种ＭｃＡｂ具有较好的型特异性和敏感性，初步表明它们可作为鉴定向毒毒素的较好的诊断试剂。应用所得的１５种ＭｃＡｂ，不论是单独或组合后，均对Ｃ型?

A型肉毒毒素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备并鉴定抗A型肉毒毒素重链C端(BoNT/AHc)鼠源单抗。方法:以BoNT/AHc蛋白为抗原免疫小鼠,利用杂交瘤技术获得鼠源单抗,通过抗体分型、SDS-PAGE、Western印迹及ELISA法分析鉴定。结果:筛选得到3株鼠单抗1B1、1B2、1C6,重链类型均为IgG1,轻链类型均为κ型;3株纯化抗体的纯度达90%以上,均能与抗原BoNT/AHc特异性结合,亲和力常数分别为1.43×10~8、2.31×10~8、1.44×10~9L/mol;叠加ELISA结果显示3株抗体与抗原BoNT/AHc结合位点相同或相近。结论:筛选得到3株能与BoNT/AHc特异性结合的鼠源单抗,为A型肉毒毒素中和抗体的研发,以及快速有效的肉毒毒素检测方法的建立奠定了基础。

经皮面神经电刺激结合A型肉毒毒素对偏侧面肌痉挛患者神经电生理、睡眠及复发的影响

目的探讨经皮面神经电刺激结合A型肉毒毒素治疗偏侧面肌痉挛患者的临床效果。方法选取偏侧面肌痉挛患者80例,按随机数字表法分为对照组、观察组,每组40例。对照组采取A型肉毒毒素重复注射,观察组采取A型肉毒毒素重复注射+经皮面神经电刺激。比较2组起效时间、痉挛缓解时间、不良反应发生率及复发率,比较治疗前后痉挛程度、神经电生理(复合肌肉动作电位、瞬目反射)、睡眠质量[匹兹堡睡眠质量指数(Pittsburgh sleep quality index,PSQI)]。结果观察组起效时间短于对照组,痉挛缓解时间长于对照组(P<0.05)。治疗后,2组痉挛程度优于治疗前,观察组痉挛程度优于对照组(P<0.05);2组复合肌肉动作电位高于治疗前,瞬目反射波幅R1、R2、R2′低于治疗前,复合肌肉动作电位高于对照组,瞬目反射波幅R1、R2、R2′低于对照组(P<0.05);2组PSQI评分低于治疗前,观察组PSQI评分低于对照组(P<0.05)。2组不良反应发生率和复发率差异无统计学意义(P>0.05)。结论经皮面神经电刺激结合A型肉毒毒素治疗偏侧面肌痉挛患者安全有效,可改善痉挛症状、神经功能、睡眠质量。

A型肉毒毒素治疗慢性偏头痛合并三叉神经痛1例

慢性偏头痛是指病人连续3个月以上每月头痛至少15天,以反复发作的中重度搏动性头痛为特点的神经系统疾病,常有恶心、畏光等伴随症状。三叉神经痛是在三叉神经分布区域反复发生的、以电击样突发剧烈疼痛为特点的神经系统疾病。这两种疾病都会严重影响病人的生活质量。偏头痛合并三叉神经痛发生率低且研究较少,目前的报道多分别针对这两种疾病进行药物治疗[1]。但长期的大剂量药物治疗不仅会使病人依从性降低,还增加药物不良反应的发生率。我科收治1例慢性偏头痛合并原发性三叉神经痛病人,对其行A型肉毒毒素注射治疗,同时治疗偏头痛及三叉神经痛,效果良好,现报告如下。

F型肉毒毒素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备F型肉毒毒素(BoNT/F)鼠源单克隆抗体。方法:以BoNT/F重链C端(BoNT/FHc)为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后尾血效价最高小鼠的脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞Sp2/0在聚乙二醇作用下进行细胞融合,ELISA筛选阳性细胞孔,通过有限稀释法分离能稳定分泌抗体的细胞株。小鼠腹腔注射杂交瘤细胞制备的腹水利用Pro tein G进行亲合层析纯化,SDS-PAGE检测抗体纯度,非竞争ELISA测定抗体亲和力常数,亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型,PCR扩增抗体轻重链可变区基因并经Vbase软件分析抗体框架区与互补决定区(CDR)氨基酸序列。结果:经过3轮免疫后,5只小鼠尾血效价均达到1∶16000,其中2号鼠尾血效价最高;杂交瘤细胞融合率为74.48%,阳性率为11.54%;2轮克隆化后筛选得到7株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,选择其中细胞培养上清效价最高的1F4制备抗体;腹水纯化后1F4抗体纯度超过95%,与BoNT/FHc抗原的亲和力常数为1.08×10^-8 mol/L;亚型鉴定结果表明1F4重链和轻链分别为IgG1型和κ型,抗体可变区氨基酸序列分析显示1F4重链和轻链CDR3序列为TRHGYFPSWFAY和QQHYSTPWT。结论:筛选到一株高亲和力的鼠源单克隆抗体,为BoNT/F检测和中和抗体的研发奠定了基础。

A型肉毒毒素联合复方倍他米松治疗带状疱疹后神经痛的临床观察

目的 观察A型肉毒毒素(BTX-A)联合复方倍他米松局部注射治疗带状疱疹后神经痛(PHN)的临床疗效及安全性,为临床提供参考。方法 选取2021年3月至2022年11月中山市第二人民医院收治的150例PHN患者为研究对象,按照随机数字表法分为A组、B组和C组,各50例。A组患者行BTX-A局部注射治疗,B组患者行复方倍他米松联合利多卡因治疗,C组患者行复方倍他米松、利多卡因联合BTX-A治疗。比较3组患者治疗效果、皮肤病生活质量指数(DLQI)评分、β-内啡肽(β-EP)水平、P物质(SP)水平及不良反应发生情况。结果 C组患者整体疗效优于A组、B组(P<0.05)。A组与B组整体疗效比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组患者的总有效率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组患者治疗后4周和治疗后12周的DLQI评分低于治疗前,且C组患者治疗后4周和治疗后12周的DLQI评分低于A组、B组(P<0.05)。3组患者治疗后4周和治疗后12周的β-EP水平高于治疗前,SP水平低于治疗前,且C组患者治疗后4周和治疗后12周的β-EP水平高于A组、B组,SP水平低于A组、B组(P<0.05)。3组患者不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 复方倍他米松、利多卡因联合BTX-A方案用于PHN患者的疗效显著,可有效缓解疼痛,改善生活质量,且安全性理想。

自建Lowry法测定B型肉毒神经毒素蛋白质含量

目的:探究适宜的B型肉毒神经毒素中蛋白质含量测定方法。方法:分别应用《中国药典》四部(2020版)中蛋白质测定法项下福林酚法(药典方法)和自建的Lowry法(本方法)测定3批B型肉毒神经毒素中的蛋白质含量,比较两种方法的线性关系、精密度和准确度。结果:两种方法的线性都具有良好的相关性,药典方法和本方法线性绝对系数R2分别为0.9972和0.9987;两种方法都具有良好的精密度和重复性,但本方法的相对标准偏差更低。结论:自建的Lowry法更适合B型肉毒神经毒素中蛋白质含量的测定。

A型肉毒毒素治疗原发性三叉神经痛的疗效观察

三叉神经痛（trigeminal neuralgia,TN）是神经内科常见疾病,主要表现为三叉神经分布区反复发作的、短暂的、阵发性剧痛,给患者造成极大的痛苦,严重影响了工作和生活。因其病因和发病机制不明确,治疗方法多种多样,但疗效差强人意。

A型肉毒杆菌毒素扳机点注射治疗三叉神经痛16例疗效观察

目的：评价A型肉毒杆菌毒素（BTX—A）治疗原发性三叉神经痛的疗效。方法：选取原发性三叉神经痛患者16例，于扳机点部位多点注射A型肉毒杆菌毒素，采用视觉模拟评分（VAS）和Barrow Neurological Institute（BNI）疼痛评价标准．在治疗前及治疗后1周、2周、1、3和6个月时进行疼痛测评。采用SPSS10．0软件包对数据进行统计学分析。结果：A型肉毒杆菌毒素注射治疗前VAS评分为（9．12±0．65）分，注射后1周、2周、1、3和6个月分别降至2．8±1．36、2．2±1．26、1．3±1．45、1．3±1．45和1．2±2．52分，与治疗前相比，差异均有显著性（P〈0．05）；1、3和6个月时，VAS评分较低且趋于稳定，但与1周、2周时相比，无显著差异修0．05）。16例患者均无明显全身并发症，2例治疗后1-2周出现不良反应，表现为右眼睑闭合无力和1：3角歪斜，未做任何处理，随着随访时间的延长，症状减轻，6个月时恢复正常，其余患者无任何不良反应。BNI疗效评价结果显示，治疗1周时已有较好疗效，1。3个月治疗效果最佳，6个月时复发1例．但仍有11例患者疼痛完全缓解。结论：A型肉毒杆菌毒素扳机点注射治疗原发性三叉神经痛是一种安全有效的新疗法。

膀胱壁内注射A型肉毒毒素治疗脊髓损伤患者神经原性膀胱的初步临床观察

目的：观察膀胱壁内注射A型肉毒毒素治疗脊髓损伤患者神经原性膀胱的临床效果。方法：78例脊髓损伤后神经原性膀胱患者，男59例，女19例，平均年龄38．9岁。将300单位A型肉毒毒素溶解于15ml生理盐水，使用膀胱镜注射针分30个点注射于膀胱壁，0．5ml／点。治疗前后均记录患者排尿日记，并观察药物毒副作用。结果：78例患者经第1次治疗后平均尿失禁次数由13．5次／d降至2．7次／d、平均导尿量由131ml／次增至389ml／次，平均尿失禁量由1690ml／d降至281ml／d，起效的平均时间为7．6d。10例患者在第1次注射8．9个月后接受第2次注射，平均尿失禁次数由9．7次／d降至3．7次／d，平均导尿量由108ml／次增至387ml／次。6例患者在第2次注射后5．8个月接受第3次注射，平均尿失禁次数由9．2次／d降至3．9次／d，平均导尿量由116ml／次增至364ml／次。随访期间未观察到任何毒副作用。结论：经尿道膀胱壁内A型肉毒毒素注射是治疗脊髓损伤患者神经原性膀胱的有效、安全、可多次重复应用的微创方法。

从人源天然ScFv噬菌体抗体库中筛选A型肉毒毒素特异性抗体

目的:以不同形式的A型肉毒毒素或类毒素为靶抗原,对已经构建的人源天然ScFv噬菌体抗体库进行特异性抗体的筛选及特异性抗体的序列分析。方法:制备3种不同形式的A型肉毒毒素或类毒素,抗原梯度包被免疫管,对人源天然ScFv噬菌体抗体库进行筛选,经过3轮"吸附-洗脱-扩增"淘选富集,制备单克隆噬菌体抗体颗粒,用ELISA验证ScFv的结合活性,并对获得的阳性克隆进行基因序列分析。结果:用3种不同形式的抗原进行筛选,各挑180个克隆进行单克隆噬菌体抗体颗粒的ELISA分析,其中以A型肉毒类毒素筛选获得52个阳性克隆,阳性率为28.8%,随机挑取12个克隆测序,结果表明7个ScFv序列正确且各不相同;以纯化后A型肉毒神经毒素(BONT/A)筛选获得18个阳性克隆,阳性率为10%,测序结果表明获得的14个ScFv序列正确且各不不同;以原核表达的A型肉毒毒素重链C段筛选获得122个阳性克隆,阳性率为68%,随机挑取55个克隆测序,结果表明30个正确的ScFv序列中14个系列完全相同,16个序列各不相同;结论:应用固相筛选的方法,从人源天然ScFv噬菌体抗体库可以获得肉毒毒素特异性抗体,为抗肉毒毒素马血清的更新替换提供了研究依据与应用基础。

A型肉毒毒素对比面神经显微血管减压术治疗面肌痉挛的疗效观察研究

目的观察对比A型内毒毒素与面神经显微血管减压术治疗偏侧面肌痉挛的疗效。方法收集该院神经外科2012年3月至2014年10月分别采用A型内毒毒素与面神经显微血管减压术治疗的86例面肌痉挛患者,分为手术组和A型内毒毒素局部注射组,随访对比两组疗效持续时间、不良反应发生率、显效率。结果两组疗效持续时间分别为（15.98±2.45）个月和（4.67±1.36）个月,不良反应发生率为9.3%和27.9%,显效率分别为100%和93.0%,两组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。B组患者治疗后完全缓解15例（34.9%）,明显缓解24例（55.8%）,部分缓解1例（2.3%）。B组患者BTX-A注射后24h症状即缓解,痉挛缓解起效时间为2.3~5.8d,平均（3.63±1.20）d,B组患者无不良反应发生。结论相比应用A型肉毒毒素注射治疗,显微血管减压术疗效持续时间长、显效率高,治疗面肌痉挛临床疗效较好。

A型肉毒毒素降低偏头痛大鼠颈静脉血、脑干和三叉神经节的P物质含量

目的通过观察A型肉毒毒素(botulinumtoxintypeA,BTX-A)对硝酸甘油引发的偏头痛大鼠颈静脉血浆、脑干和三叉神经节中P物质(substanceP,SP)含量变化,探讨BTX-A止痛机理。方法将大鼠分为对照组(n=5)和偏头痛模型组(n=15)。偏头痛模型组造模后分别皮下注0.9%NaCl(n=5)、BTX-A5U·kg-1(n=5)、BTX-A10U·kg-1(n=5)6d后,应用放射免疫检测法测定颈静脉血浆、脑干和三叉神经节中P物质的含量。结果动物皮下注射硝酸甘油后出现偏头痛症状,例如双耳发红、前肢频繁搔头、爬笼次数增多,其评分与对照组相比有明显差异(P<0.01)。生理盐水组颈静脉血浆、脑干和三叉神经节中SP含量与对照组比较显著升高(P<0.01);BTX-A5U·kg-1组、BTX-A10U·kg-1组分别与生理盐水组比较,SP含量显著降低(P<0.05)。结论硝酸甘油导致偏头痛症状产生及SP在颈静脉血浆和延髓、脑桥和三叉神经节中的含量增加。局部皮下注射BTX-A可减轻偏头痛大鼠的症状,并能降低颈静脉血浆、脑干和三叉神经节中SP含量,结果提示BTX-A通过抑制“三叉神经血管系统”(tri-geminalvascularsystem,TVS)中SP释放而减轻偏头痛症状。