中国部分地区艰难梭菌PCR-核糖体分型及毒素基因多态性研究

目的了解中国部分地区艰难梭菌聚合酶链反应(PCR)-核糖体型别分布及其A、B毒素基因多态性,为建立适宜中国的艰难梭菌分子检测和分子分型技术提供基础数据,同时在基因水平上为艰难梭菌感染导致的复杂临床表现提供依据。方法对中国3个城市(北京、广州、济南)分离的64株艰难梭菌临床株进行PCR-核糖体分型,并对不同型别的26株代表菌株的A、B毒素基因进行扩增测序。结果 64株艰难梭菌中,毒素基因型以A+B+型(45株,70.31%)为主,A-B+型19株(29.69%)。共存在9种PCR-核糖体型别,以017型(21株,32.81%)为主要型别,其次为001型(13株,20.31%)、012型(11株,17.19%)。A-B+菌株中,14株(73.68%)是017型,1株是001型。A、B毒素基因呈现一定的多态性,其中有7种A毒素序列型别(TSTA),6种B毒素序列型别(TSTB),8种A、B毒素序列型别组合(TSTG)。结论我国部分地区的艰难梭菌可能以PCR-核糖体017型为主,A、B毒素基因在菌株间存在多态性,且核糖体型别与毒素基因多态性间存在相对应的关联。应进一步扩大菌株数量和范围,探寻适合我国的分子检测和分子分型方法,从而帮助医院更好地预防和控制艰难梭菌感染。

不产A毒素艰难梭菌的毒力

对于不产A毒素的艰难梭菌(A^-B^+)菌株是否具有临床意义的问题曾有些不同的看法,如Webb及Brazier等就认为产B毒素而不产A毒素的菌株无任何临床意义,它的出现只不过是实验室中方法学改变的结果。然而,也有不少人认为艰难梭菌A^-B^+菌株的确是具有毒力的菌株。

魏氏梭菌PCR检测方法的建立及应用研究

根据Gen Bank发表的序列设计了α毒素引物,建立了魏氏梭菌PCR检测方法。结果表明仅魏氏梭菌扩增出了特异性条带,而大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌没出现,该方法最低检测灵敏度为1 CFU/ml。用该法对山东齐河、枣庄、泰安、蒙阴等地的猪、牛、羊、兔的样品检测,总检出率为2 0 .6% ,与细菌分离、鉴定结果一致。

A型产气荚膜梭菌KdpD/E双组份系统调节毒素基因表达的研究

目的 明确kdpD基因编码的蛋白结构特点,探究A型产气荚膜梭菌中KdpD/E系统与alpha和cpe毒素基因表达趋势的关联性。方法 用试剂盒法提取A型Cp菌的基因组DNA,PCR扩增kdpD基因并测序,对该基因测序结果进行分析及蛋白结构预测;分别提取A型产气荚膜梭菌培养2-9 h 8个时间段的总RNA,采用电泳和核酸蛋白检测仪,测定各个时间段总RNA的浓度和纯度;将RNA反转录为cDNA,用实时荧光定量PCR检测kdpD、kdpE双组份系统与alpha、cpe毒素编码基因的相对表达量。结果 生物信息学预测KdpD蛋白结构中α-螺旋占76.1%,β-折叠占23.1%,β-转角占0.855%,无规则卷曲占0.427%,无跨膜区;提取总RNA的质量较高,其A_(260)/A_(280)值在1.8~2.1之间;实时荧光定量PCR检测kdpD、kdpE、alpha、cpe基因扩增产物溶解曲线单一,同时kdpD/E基因与alpha和cpe毒素基因表达趋势相似,即随着细菌的生长,信号基因和毒素基因的表达量均增加,且在3 h和4 h增幅明显,并在4 h时表达量最高,随后逐渐降低,其中alpha毒素基因表达量的变化更为明显。结论 产气荚膜梭菌kdpE基因的蛋白结构预测符合其作为应答调节蛋白的结构功能,A型Cp菌中KdpD/E双组份信号系统与alpha和cpe毒素基因的表达存在一定的相关性,alpha毒素作为A型产气荚膜梭菌产生的主要毒素与KdpD/E系统的相关性更显著。