重组大鼠高迁移率族蛋白B1 A结构域(HMGB1-A)的原核表达及纯化

目的合成重组大鼠高迁移率族蛋白B1 A结构域(HMGB1-A)蛋白。方法利用基因工程技术,克隆并重组大鼠高迁移率族蛋白B1 A盒基因;利用原核表达技术,表达并纯化重组大鼠HMGB1-A盒蛋白,并利用Western blot法进行验证。结果琼脂糖凝胶电泳分析显示HMGB1-A盒基因大小约为250 bp;重组克隆p UC-A经双酶切鉴定,产物大小约为3000 bp、250 bp;重组克隆p GEX-A PCR产物大小约为250 bp。原核表达产物Mr大小约为36 000,与预期一致。结论成功表达并纯化HMGB1-A盒蛋白。

重组HMGB1-A盒蛋白对小鼠单核细胞的抗炎作用

目的:观察高迁移率蛋白B1-A盒蛋白(HMGB1-Abox)对小鼠单核细胞系在脂多糖(LPS)刺激下表达HMGB1的影响和动态变化以及对炎性因子分泌的抑制作用。方法:利用克隆载体构建PET28a-HMGB1-Abox原核质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)诱导后经Ni2+-NTA树脂亲和纯化得到目的蛋白;以不同浓度的重组HMGB1-Abox蛋白作用于LPS刺激的小鼠单核细胞系RAW264.7,CCK8试剂盒检测其对小鼠单核细胞活力的影响。以PBS和重组HMGB1-Abox蛋白为对照组和实验组,于2、6、12、24、48小时检测其细胞上清中的TNF-α、IL-1β的含量,Western blot、免疫荧光法观察细胞中HMGB1的表达、RT-PCR检测细胞中HMGB1-mRNA变化趋势。结果:成功构建PET28a-HMGB1-Abox原核质粒并纯化出大约为14 kD的目的蛋白。小鼠单核细胞活力与重组HMGB1-Abox蛋白浓度及作用时间呈正相关;实验组细胞上清TNF-α、IL-1β的含量较对照组显著下降;Western blot及免疫荧光检测提示实验组细胞中HMGB1表达不断减少;细胞中HMGB1-mR-NA含量及峰值均较对照组显著减少且延后。结论:重组HMGB1-Abox蛋白可以显著减少小鼠单核细胞在受到LPS刺激时HMGB1的表达和分泌,从而有效的阻断HMGB1对其他早期炎性因子的促进作用,减少炎性因子的分泌,有较强的抗炎作用。

LncRNA ABHD11-AS1在Erastin诱导的胰腺癌细胞铁死亡中的作用及其机制

目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)α/β-水解酶结构域蛋白11的反义链1(α/β-hydrolase domain containing protein 11-antisense strand 1,ABHD11-AS1)在Erastin诱导的胰腺癌细胞铁死亡中的作用及其潜在机制。方法:通过GEPIA平台分析ABHD11-AS1在胰腺癌中的表达和患者预后。采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测人胰腺癌PANC1、MIApaca-2和PaTu8988细胞中ABHD11-AS1表达,CCK8法计算Erastin半数抑制浓度(IC_(50))。在PANC1细胞中过表达ABHD11-AS1,分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-ABHD11-AS1质粒;在PaTu8988细胞中干扰ABHD11-AS1表达,分别转染siControl、siRNA1、siRNA2,qRT-PCR检测转染效率,分别予以对照(0μmol/L Erastin)、Erastin(IC_(50)浓度)处理,CCK8法检测细胞活性,ELISA法检测丙二醛和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量;另在pcDNA3.1-ABHD11-AS1和siRNA1组加入Erastin的同时加入铁死亡挽救剂Ferrostatin-1,坏死挽救剂Necrostatin-1或凋亡挽救剂Z-VAD-FMK,CCK8法检测细胞活性;免疫印迹法检测5组胰腺癌细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)以及磷酸化mTOR(p-mTOR)表达水平。结果:胰腺癌组织中ABHD11-AS1表达水平明显高于癌旁组织,高表达ABHD11-AS1组患者预后较差(P<0.05)。ABHD11-AS1相对表达量由低到高依次是人胰腺癌PANC1、MIApaca-2和PaTu8988细胞,Erasin IC_(50)趋势与ABHD11-AS1表达量相同,依次是2.245、11.760、17.120μmol/L。与pcDNA3.1组相比,pcDNA3.1-ABHD11-AS1组细胞活性及GSH含量明显增高,而丙二醛含量明显降低(P<0.05);与siControl组相比,siRNA1组和siRNA2组细胞活性及GSH含量明显降低,丙二醛含量明显增高(P均<0.05)。仅Ferrostatin-1可以挽救pcDNA3.1-ABHD11-AS1和siRNA1组细胞活性(P<0.05)。过表达ABHD11-AS1可促进mTOR活化,增强GPX4表达(P<0.05);而干扰ABHD11-AS1则相反。结论:LncRNA ABHD11-AS1可通过活化mTOR促进GPX4表达,从而促进胰腺癌细胞铁死亡抵抗。

高迁移率族蛋白B-1和钙粒蛋白在矽肺发病中的作用

目的探讨高迁移率族蛋白B-1（HMGB1）和钙粒蛋白（S100）在矽肺发病中的作用，为充分认识炎症在其中的地位提供新的理论依据。方法选C56BL／6小鼠48只，分为6组：对照组及3、7、14、21、42天实验组，每组8只。进行支气管染矽尘，染尘浓度为200mg／kg。在不同的观察时间处死动物，收集支气管灌洗液，离心后沉淀用于细胞计数。上清液用于检测HMGB1、S100和肿瘤坏死因子-a（TNF-a）。分离肺组织，取右肺用Westernblot检测RAGE。左肺做病理切片，光镜下观察肺组织的病理改变。结果（1）支气管灌洗液中巨噬细胞和中性粒细胞在3d和21d时表现最高，与7、14、42d比较差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）HMGB1和S100在染尘3—21d时逐渐增高且具有时间效应关系（P〈0．05），42d时有所降低。（3）TNF—a在3～14d染尘时逐渐降低，21d又升高，42d时明显下降，且各时段间差异有统计学意义（P〈0．05）。（4）RAGE表达水平随观察时间的延长明显降低，并具有时间效应关系（P〈0．05）。（5）随着观察时段的延长，肺泡壁增厚，结构明显破坏，肺泡腔逐渐融合，肺组织炎性病灶增多，在42d时形成了大量的纤维化，几乎看不清肺泡结构。结论HMGB1和钙粒蛋白可能参与矽肺晚期炎症的形成，其生物学效应的发挥不依赖RAGE受体。

丹参酚酸B通过高迁移率族蛋白1抑制氧化应激诱导的内皮细胞焦亡

目的探讨丹参酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)在内皮细胞氧化应激损伤中的保护作用。研究对象提取原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),将获取的细胞分成7个实验组:(1)对照组,(2)过氧化氢(hydrogen peroxide,H_(2)O_(2))组,(3)H_(2)O_(2)+Sal B组,(4)Sal B组,(5)H_(2)O_(2)+小干扰核糖核酸(small interfering RNA,siRNA)阴性对照(negative control,NC)组,(6)H_(2)O_(2)+高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)siRNA组,(7)H_(2)O_(2)+Sal B+HMGB1 siRNA组。干预措施(1)对照组:予1‰二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)处理;(2)H_(2)O_(2)组:予200μmol/L H_(2)O_(2)处理;(3)H_(2)O_(2)+Sal B组:10μmol/L Sal B预处理24 h后再予200μmol/L H_(2)O_(2)处理;(4)Sal B组:10μmol/L Sal B预处理24 h后再予1‰DMSO处理;(5)H_(2)O_(2)+siRNA NC组:siRNA NC预处理24 h后再予200μmol/L H_(2)O_(2)处理;(6)H_(2)O_(2)+HMGB1 siRNA组:HMGB1 siRNA预处理24 h后再予200μmol/L H_(2)O_(2)处理;(7)H_(2)O_(2)+Sal B+HMGB1 siRNA组:10μmol/L Sal B及HMGB1 siRNA预处理24 h后再予200μmol/L H_(2)O_(2)处理。观测指标及测量方法采用荧光探针法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、细胞线粒体膜电位及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平;采用透射电镜观察细胞结构变化及采用Annexin V/PI染色进行流式分析检测细胞膜破损情况;使用蛋白质印迹(Western blot,WB)法检测氧化应激状态下细胞焦亡相关蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)、胱天蛋白酶-1(caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)蛋白;利用siRNA瞬时敲低细胞中HMGB1,观察有无Sal B预处理细胞中焦亡相关分子NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1、IL-1β蛋白表达情况。实验结果使用Graphpad Prism8软件进行统计分析并作图,结果以x-±s显示,组间对比采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果与H_(2)O_(2)组对比,通过细胞计数试剂8(cell counting kit-8,CCK8)检测显示H_(2)O_(2)+10μmol/L Sal B组增加内皮细胞的存活率(P<0.0001),降低细胞内ROS水平(相对荧光单位P<0.0001),维持细胞内线粒体膜电位及ATP生成(P<0.01),膜联蛋白V/碘化丙啶染色流式显示细胞膜破损程度减轻(P<0.001),降低细胞内HMGB1信使RNA(messenger RNA,mRNA)表达量(P<0.01)及HMGB1蛋白浓度(P<0.01),同时抑制细胞内焦亡相关分子NLRP3(P<0.05)、GSDMD(P<0.05)、ACS(P<0.05)、caspase-1(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)表达。使用siRNA瞬时敲低细胞内HMGB1,与H_(2)O_(2)+Sal B组对比,H_(2)O_(2)+Sal B+HMGB1 siRNA组进一步降低HMGB1表达(P<0.05),同时抑制细胞焦亡过程中NLRP3激活(P<0.05),进一步减少GSDMD(P<0.05)、ASC(P<0.05)、caspase-1(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)等的释放,表明敲低HMGB1可减轻内皮细胞的焦亡损伤,同时增加Sal B对内皮细胞的保护作用。结论Sal B通过降低ROS水平抑制HMGB1,维持线粒体内氧化还原稳态,抑制内皮细胞中NLRP3炎性小体形成,改善内皮细胞焦亡。