A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物的制备及其工艺稳定性

目的按初步确定的工艺,制备A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖(Group A Neisseria meningococcus capsular polysac charide,GAMP)与破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)的结合物,通过监测关键工艺参数,分析该工艺的稳定性。方法制备8批GAMP-TT结合物,经Sepharose4FF柱层析纯化后,进行各项生化鉴定,采用双向免疫扩散试验检测其抗原性,以结合物皮下免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清中抗GAMP及抗TT IgG抗体水平。结果制备的8批结合物工艺关键参数较稳定,均保持GAMP抗原特异性;免疫小鼠后,均可诱生较高水平的血清抗GAMP IgG抗体,并可诱生免疫加强应答。结论该制备工艺稳定,为GAMP-TT结合疫苗的研制提供了参考。

A群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性研究

采用溴化氰(CNBr)活化多糖,以无水己二酸二肼(ADH)作为连接剂,1乙基13(3二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)为偶联剂制备A群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖(GAMP)与破伤风类毒素(TT)的结合物,经皮下免疫NIH小鼠,用ELISA检测小鼠血清中抗GAMP及抗载体蛋白的IgG抗体水平。用补体介导的体外杀菌试验检测血清中GAMP抗体的杀菌活性。结果显示,实验中制备的多糖衍生物和多糖蛋白质结合物都具有GAMP抗原特异活性。结合物免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的GAMP血清IgG抗体,并能形成免疫记忆,产生再次应答。结合物免疫小鼠所诱生的血清GAMP抗体较之多糖组具有更强的体外杀菌活性。表明此方法制备的结合物可获得优于多糖的、稳定的特异免疫原性。

C群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗的制备及其在小鼠体内免疫原性的研究

将C群脑膜炎球菌荚膜多糖以ADH作为间隔剂与TT结合形成GCMP-TT结合疫苗,然后用此结合疫苗免疫NIH小鼠,结果显示使用GCMP免疫小鼠后仅能产生较低水平抗GCMP的IgG抗体,而用GCMP-TT免疫后小鼠血清中产生了较GCMP免疫显著增高抗GCMP的IgG抗体,并且GCMP-TT组第二次和第三次免疫后与初次免疫相比,IgG抗体水平均有显著升高(P<0.01),表明GCMP-TT结合疫苗具有免疫记忆和再次免疫加强应答效应。补体介导的血清抗体体外杀菌试验结果证明,GCMP-TT结合疫苗组免疫小鼠诱导的抗体IgG比GCMP组具有增强的体外杀菌活性。

不同的甲醛杀菌浓度对A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖内毒素含量的影响

目的研究不同的甲醛杀菌浓度对A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖内毒素含量的影响。方法将A群脑膜炎球菌发酵液分成A、B两组,A组采用体积分数为2.5%甲醛杀菌,B组采用体积分数为2.0%甲醛杀菌。将C群脑膜炎球菌发酵液分成C、D两组,C组采用体积分数为2.5%甲醛杀菌,D组采用体积分数为2.0%甲醛杀菌。分别纯化获得荚膜多糖,用动态浊度法测定荚膜多糖中内毒素的含量。结果 A、C两组荚膜多糖中内毒素含量显著低于B、D两组荚膜多糖中的内毒素含量(P<0.05)。结论使用不同浓度的甲醛杀菌,对A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖内毒素的含量有显著影响。较高浓度的甲醛利于菌体细胞的固定,从而防止细菌自溶释放内毒素,因而高浓度的甲醛能够减少其内毒素的含量,提高了产品质量。

一种新的CTAB加入方法对A群脑膜炎球菌荚膜多糖分子大小的影响

目的：探讨CTAB不同的加入方法对A群脑膜炎球菌荚膜多糖分子大小的影响。方法采用分次加入手动搅拌和持续加入机械快速搅拌两种CTAB加入方法，纯化获得荚膜多糖粗糖，分别编为B组和C组。将两组荚膜多糖粗糖分别纯化获得精糖，分别编为D组和E组。以SepharoseCL-4B凝胶层析纯化获得荚膜多糖并检测其KD值。结果B组荚膜多糖粗糖的KD值介于0．34～0．35之间，C组荚膜多糖粗糖的KD值介于0．03～0．05，进一步用苯酚纯化获得精糖后KD值D组介于0．34～0．36之间，E组介于0．22～0．28之间。两组相比KD值显著降低。结论CTAB的加入过程对A群脑膜炎球菌荚膜多糖的分子大小有明显的影响，CTAB沉淀时进行快速而充分的搅拌，纯化获得的荚膜多糖相对分子质量更大。

新型脑膜炎奈瑟球菌X群荚膜多糖单克隆抗体及其潜在应用

针对脑膜炎奈瑟球菌X群荚膜多糖（Men X）研制的一种新型鼠杂交瘤细胞单克隆抗体（MAb）可用于酶联免疫法对脑膜炎球菌多糖进行定量。该单克隆抗体只对X群发生反应,对于脑膜炎奈瑟菌A群C群Y群和W群均不反应。由非竞争性ELISA测定的单克隆抗体的亲和常数值（Ka）为7.25×107/M。

A群脑膜炎奈瑟菌多糖IgG抗体检测试剂研制

目的研制检测A群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖IgG抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂。方法以CTAB、酚、乙醇从A群脑膜炎奈瑟菌培养上清中提取荚膜多糖（MenA PS）,将多糖与卵清蛋白（EA）以还原氨基法偶联,并以Sepharose CL-4B纯化。优化反应条件,建立以偶联物MenA PS-EA为包被抗原检测A群脑膜炎奈瑟菌多糖IgG抗体的间接ELISA法,并与血清杀菌力试验（SBA）比较。结果高效液相色谱检测MenA PS-EA结合物纯度为81.50%。试剂具有良好重复性（变异系数CV=4.26%～5.30%）;37℃放置7d、4℃放置12个月,试剂的灵敏度不变,具有优良的稳定性;分别用该试剂和SBA法检测192份血清,试剂相对于血清杀菌力试验的灵敏度为96.91%,特异度为90.00%,一致性为95.83%,统计学分析表明,2种检测方法之间差异无统计学意义。结论以纯化MenA PS-EA作为包被抗原建立的A群脑膜炎奈瑟菌多糖特异性IgG抗体间接ELISA检测试剂具有可行性,为进一步研究及开发细菌多糖类抗体诊断试剂提供了可借鉴的方法。

W_(135)和Y群脑膜炎球菌培养和多糖纯化

目的培养W135和Y群脑膜炎球菌及荚膜多糖的纯化。方法采用综合培养基代替半综合培养基在75L生物反应器中对两群脑膜炎球菌进行培养,研究培养基处方、发酵、多糖提取及纯化工艺。结果综合培养基可代替半综合培养基对两群脑膜炎球菌进行培养。在培养过程中补加葡萄糖溶液、优化搅拌速度及通气量均有利于两菌群生长;在多糖纯化过程中,通过对比试验选择25%乙醇沉淀核酸,2～8℃的酚溶液,萃取蛋白的次数控制在3～4次为好。结论所研制的综合培养基及多糖纯化的工艺具有较好的可行性,为四价脑膜炎球菌多糖疫苗的研制提供了试验基础。

A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗衍化工艺的研究

目的:筛选和优化A群脑膜炎多糖的衍化工艺。方法:将A群奈瑟氏脑膜炎球菌多糖经溴化氰活化后通过己二酰肼衍生后制备出适宜的多糖衍生物。对衍化条件进行摸索和优化后通过衍化率及衍生物的可溶性来考察衍化效果,同时通过生化指标来考察该衍生工艺制备的结合疫苗的质量和收率。结果:在pH 11.0±0.2、活化30 min以及溴化氰与多糖比值(w/w)=0.5时,衍生物制备的结合疫苗各项生化指标在所筛选的条件中最优。结论:经过筛选优化的衍生工艺提高了多糖的衍化率,适宜结合疫苗的研制,保证了其结合疫苗的免疫原性。

超滤液用量对C群脑膜炎奈瑟球菌精制多糖质量的影响

目的:研究不同的超滤液用量对C群脑膜炎奈瑟球菌精制多糖质量的影响。方法:对C群脑膜炎奈瑟球菌多糖苯酚法去蛋白后的多糖液进行超滤,超滤液为0.5 mol/L氯化钙溶液,反复浓缩超滤。当超滤液用量达到20 L、30 L、40 L和50 L时,分别从截留管处取多糖液5 mL用于苯酚残留量的检测。对比超滤液用量为20 L和50 L时精制多糖的分子量、回收率、细菌内毒素和收率结果。结果:随着超滤液用量的增大,苯酚残留量逐渐降低;超滤液用量为50 L时,多糖分子量升高,精制多糖收率略有提高;细菌内毒素没有明显变化。结论:当超滤液用量为50 L时,多糖液中苯酚残留量降为0 g/L,多糖分子量升高,精制多糖收率略有增加,从而提高了多糖产品的质量。

用多糖-破伤风类毒素结合苗制备抗流行性脑膜炎球菌多糖单克隆抗体

目的 研制抗A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖单克隆抗体（GAMP mAb）.方法 以A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素（GAMP-TT）耦联物免疫BALB/c小鼠,用常规细胞融合与克隆化技术获得一株能稳定分泌抗GAMP mAb的杂交瘤细胞株（2E7）.采用秋水仙素阻断法测定其染色体数目,降植烷诱导法制备含该抗体的小鼠腹腔积液,辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）灰度扫描测定提取物纯度,改良过碘酸盐氧化法制备辣根过氧化物酶（HRP）标记抗GAMP mAb,并采用中和法及其抗原替代法对抗GAMP mAb的特异性进行初步的鉴定.结果 所获得的杂交瘤细胞（2E7）具有很好的生长特性,染色体数目约为139.73条;抗体分泌量适中,Ig亚类为IgG1,提取物浓度1.76～2.32 mg·mL-1,纯度97.2%,标记抗GAMP mAb的效价为1：25 600;抗原替代实验与中和实验对其特异性考核,初步结果证实2E7 mAb具有很好的抗GAMP特异性.结论 成功制备抗GAMP mAb,为GAMP-TT疫苗的生产监测及产品质量控制提供了必要的物质基础.

C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗衍化工艺研究

目的筛选和优化C群脑膜炎多糖的衍化工艺。方法将C群奈瑟脑膜炎球菌多糖经溴化氰活化后通过己二酰肼衍生后制备出适宜的多糖衍生物。对衍化条件进行摸索和优化后通过衍化率及衍生物的可溶性来考察衍化效果,同时通过生化指标来考察该衍生工艺制备的结合疫苗的质量和收率。结果在pH11.0±0.2、活化30min以及溴化氰与多糖比值(W/W)=0.5时,所获衍生物制备的结合疫苗各项生化指标在所筛选的条件中最优。结论经过筛选优化的衍生工艺提高了多糖的衍化率,适于结合疫苗的研制,保证了结合疫苗的免疫原性。

W135群脑膜炎球菌发酵工艺的研究

为研究A、C、Y、W135群流脑多糖疫苗,针对W135群脑膜炎球菌的生长特性,采用国产50L发酵罐,针对流脑半综合液体培养基中葡萄糖浓度;培养温度、菌种接种浓度、pH、通氧量及搅拌速度等因素对W135群脑膜炎球菌生长的影响,选择最适的培养条件.结果表明,选择半综合培养基中补加1%的葡萄糖培养效果良好,菌种接种浓度直接影响多糖复合物产量;最适pH值6.5～7.5的范围可维持W135群链球菌快速生长;温度控制在36.5±0.2℃可得到较高的培养产物;培养过程中加大通气量及搅拌速度对培养结果有明显改善.确立了W135群脑膜炎球菌的最适培养条件,在确定培养条件后连续进行3批500L罐放大中试培养,达到规模化生产要求.

B群奈瑟脑膜炎球菌引起休克型流行性脑脊髓膜炎1例报道

患者，女，16岁，学生，因发热、恶心、呕吐17h，手足发绀3h，于2006年12月9日10：30入院。患者开始发病时，感觉全身酸痛不适，发热，体温39．0℃左右，双眼眶胀痛，恶心、呕吐2次，偶有右下肢抽搐。在校医务室治疗，静脉滴注克林霉素，症状无好转。后发现颜面及躯干散在淤点，阴道有少量出血（非经期）；入院前3h患者逐渐出现四肢厥冷，

SEA为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物初步免疫效果评价

目的对以金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物的免疫效果进行初步评价。方法采用1-氰基-4-二甲氨基-砒啶四氟硼酸(1-cyano-dimethylamino pyridiniumtetrafluoroborate,CDAP)活化法,将SEA、破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)分别与A群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group A N.meningitidis capsular polysaccharide,GAMP)、C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group C N.meningitidis cap-sular polysaccharide,GCMP)结合制备结合物;将结合物分别免疫BALB/c小鼠,腹部皮下免疫3次,于第1针免后第9天、第19天、第27天眼眶采血,分离血清备用;检测体液免疫及细胞免疫反应水平。结果 SEA与GAMP结合后能增强抗-GAMP Ig G抗体水平,第3次免后GAMP-SEA组多糖抗体水平达到1∶12 800,高于GAMP组1∶400,但GCMP-SEA组结果不理想。SEA与GAMP结合后均能激发细胞免疫反应,IFN-γ和IL-4的SFC与GAMP组比较均升高,且IFN-γ高于IL-4。SEA与GAMP、GCMP结合后Th1/Th2细胞亚群比值分别达到23.48和22.19,高于GAMP组(14.09)和GCMP组(16.73),差异有统计学意义(P<0.05),提示SEA与GAMP、GCMP结合后可激发细胞免疫。结论 SEA与GAMP、GCMP结合后既能增强GAMP、GCMP的免疫原性,提高体液免疫反应,又能激发细胞免疫反应,提示SEA具备作为A/C群脑膜炎奈瑟菌结合疫苗载体蛋白的可行性。

由脑膜炎奈瑟菌W135血清群引起的5例脑膜炎球菌病患儿的临床表现和转归

Meningococcal disease due to Neisseria meningitidis of serogroup W135 (N.meningitidis W135) is increasing in France.Clinical and outcome data concerning these infections in children are scarce.We report five cases of children hospitalized between June 2000 and December 2002 for N.meningitidis W135 infection.Extra-meningeal septic and/or non-septic complications were frequent and a prolonged postmeningococcal inflammatory syndrome was reported.In N.meningitidis W135 infections a careful clinical evaluation of potential extrameningeal complications and a long term follow up of children are needed.

b型流感嗜血杆菌奈瑟球菌荚D蛋白作为载体的膜多糖C群脑膜炎-蛋白结合物的免疫效果评价

目的对b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)D蛋白(protein D,PD)作为载体的C群脑膜炎奈瑟球菌荚膜多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)-蛋白结合物进行免疫效果评价,以确定PD作为GCMP蛋白载体的可行性。方法采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(CDAP)活化法,将重组PD、破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)分别与GCMP结合制备结合物;将GCMP及结合物分别经腹部皮下免疫雌性BALB/c小鼠,分为GCMP、GCMP-PD、PD、GCMP-TT、TT及阴性对照(生理盐水)组,每组12只,共免疫3次,分别于每次加强免疫前及末次免疫后7 d,经眼眶采血,分离血清,用于抗体水平检测及血清杀菌力试验(serum bactericidal assay,SBA);同时在末次免疫后7 d取脾脏,进行细胞免疫水平检测。结果蛋白与GCMP结合后能增强抗-GCMP抗体IgG水平,第3次免疫后,与单独GCMP组相比,GCMP-PD和GCMP-TT组小鼠血清抗-GCMP IgG水平均显著升高(F分别为5.294、14.917,P均<0.05),且产生免疫记忆,诱导IgG1产生,但GCMP-PD组低于GCMP-TT组(F=5.828,P<0.05);CMP-PD、PD组小鼠血清抗-PD IgG抗体水平各次免疫后均显著增长,第3次免疫后,GCMP-PD组抗-PD IgG抗体水平显著高于PD组(F=15.426,P<0.01),而GCMP-TT组低于TT组(F=211.207,P<0.001)。SBA结果显示,GCMP-PD组杀菌抗体滴度高于GCMP组(F=11.797,P<0.05),但低于GCMP-TT组(F=8.688,P<0.05)。流式细胞术结果显示,GCMP-PD组Th1、Th2细胞亚群比值与GCMP及GCMP-TT组相比,差异均无统计学意义(F分别为0.073、3.021,P均>0.05)。结论重组PD与GCMP结合后,既能增强多糖疫原性,提高体液免疫反应能力,也能激发细胞免疫反应,同时免疫后血清杀菌效果显著,提示PD具备作为GCMP蛋白载体的可行性。

C群脑膜炎球菌结合疫苗的质量控制与生产的科学挑战

世界卫生组织 (WHO)生物制品标准化专家委员会于 1976年通过了脑膜炎球菌多糖疫苗的建议 ,并于 1978年和 1981年进行了修订。在临床研究中 ,疫苗的有效率至少达 90 % ,证明其在疫苗接种计划中高度有效。然而 ,不能在幼婴中诱生保护性应答或免疫记忆制约了其在英国婴儿免疫接种计划中的应用。随着 b型流感杆菌 (Hib)结合疫苗的成功引入 ,C群脑膜炎球菌 (Men C)荚膜多糖结合疫苗的研究取得了显著的进展。临床对照试验已证实它们在所有年龄组中均可诱生针对 Men C多糖的保护性水平的抗体 ,并且作为 T细胞依赖性抗原 ,能诱导免疫记忆和抗荚膜抗体的亲和力成熟。英国引入 Men C结合疫苗后 ,证实该疫苗可提供保护性免疫。 WHO已经制定了有关这些新疫苗生产和检定的建议。