合成生物学在多糖结合疫苗研发中的应用

由于合成生物学的快速发展,目前已经实现了人工设计DNA和蛋白质的合成,对具有重要生物学功能、结构也更为复杂的糖类物质进行精准设计合成,也将是合成生物学未来发展的重要方向。近年来,一种基于细菌寡糖转移酶体系的蛋白多糖偶联技术发展迅速,已被广泛应用于病原细菌多糖结合疫苗的生物合成制备。本文综述了该技术体系中的寡糖转移酶元件、载体蛋白元件、异源多糖抗原合成线路以及工程菌株改造等核心关键模块的最新研究进展。使用生物活体系统,发酵生产多糖结合疫苗,具有产物均一性好、步骤简便、绿色环保等优势,是一种亟待发展的新兴技术,同时也存在一些技术细节需要完善。未来,寡糖转移酶的定向进化、纳米颗粒型蛋白载体的应用、多糖合成基因的组合重排、工程菌株的代谢途径优化,将有望进一步促进多糖结合疫苗的生物合成研究。

离子色谱在多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗质量控制中的应用

离子色谱具有方便、快速、灵敏度高、选择性好、重现性好、准确度高、可同时分析多种离子化合物等优点,其中的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)可直接分析糖类物质,可应用于多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗中多糖的分析。近年来,离子色谱应用在多糖及多糖蛋白结合疫苗的质量控制中,如测定疫苗中的多糖、游离糖、杂质多糖、对人有免疫原性的功能基团等的研究有许多报道,对有关内容进行了综述。

肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的研制及其在幼小鼠体内诱导的免疫应答

目的研制肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗,并通过幼小鼠的动物实验检测其免疫原性。方法用19F 型肺炎球菌多糖以氨基还原法分别与牛血清白蛋白及鸡卵清蛋白偶联结合,以凝胶柱纯化,加入铝佐剂制备成疫苗,然后分别以3种不同多糖含量的结合疫苗腹腔接种3wk 龄幼小鼠,每隔2wk 复种一次,接种3次后采血。多糖对照组幼小鼠以19F 型肺炎球菌多糖疫苗接种,阴性对照组以0.15 M PBS 接种。用 ELISA 法检测动物血清中抗肺炎球菌多糖抗体水平。结果经层析后肺炎球菌多糖蛋白结合物的 OD 峰值较多糖及载体蛋白的各自峰值均明显前移,以多糖含量分别为0.25μg、1.0μg、4.0μg的结合疫苗接种的3组幼小鼠血清中抗肺炎球菌多糖抗体平均滴度分别为1:400、1:800、1:1600,多糖对照组为1:50(P<0.05)。结论已建立制备肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的方法,该疫苗能在幼小鼠体内引起明显的免疫应答。

细菌性多糖-蛋白质结合疫苗的免疫学

本文对细菌性表面多糖 (CPS ,O SP)的免疫原性、影响多糖免疫原性的因素、多糖 蛋白质的免疫学机理进行了综述。

顶空气相色谱法测定四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环

目的建立并验证四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环的检测方法。方法采用顶空气相色谱法,样品中加入碳酸钠固体,产生"盐析"效应,以增加二氧六环在顶空瓶中的浓度。通过HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm,5%Phenyl Methyl-Siloxane),氢火焰检测器测定四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环。结果二氧六环平均回收率及变异系数分别为86.16%～106.54%和2.4%～8.7%,在0.5004～40.032mg/L范围内相关系数值r=0.999 41,线性关系好,最低检测限为0.5 mg/L,最低定量限为2.5 mg/L。结论该方法溶剂用量少、灵敏度高、出峰特异、专属性强、色谱峰型好、分离度高、出峰时间短、影响因素少,是一种易于实现仪器自动化的分析方法。

脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗研究进展

流行性脑膜炎是细菌性脑脊髓膜炎中唯一能造成流行的疾病,可引起相当高的病死率和致残率。流脑从病原体的发现至今已超过100年,呈世界范围分布,全世界每年流脑病例可达30万到35万,是世界范围的一个严重公共健康问题。

细菌性多糖蛋白结合疫苗免疫应答机制的研究进展

细菌性多糖蛋白结合疫苗是一类重要的、安全有效的预防疫苗。目前该疫苗在控制由流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌等引起的感染性疾病中已取得了巨大的成功,尤其是针对两岁以下的婴幼儿。然而,由于缺乏对其免疫激活机制的了解,多糖蛋白结合疫苗仍存在一些问题,如在高危人群中免疫原性较低。因此,了解细菌性多糖蛋白结合疫苗在机体内的免疫应答机制至关重要,以便设计更为合理的疫苗。传统的免疫机制认为,T淋巴细胞活化是由提呈的多肽诱导,即多糖蛋白结合物中载体蛋白部分的加工产物。近年来,已发现T细胞识别多糖的新机制,显示多糖蛋白结合疫苗的多糖部分积极参与T细胞活化。现就近年来细菌性多糖蛋白结合疫苗免疫应答机制的相关研究作一概述。

破伤风类毒素-细菌多糖结合疫苗中载体蛋白识别的结构性标志物

细菌性脑膜炎的全球负担主要是由于奈瑟脑膜炎球菌和肺炎链球菌的侵袭性感染造成的。发达国家在1987年引入b型流感嗜血杆菌（Hib）结合疫苗前,Hib是许多细菌性脑膜炎的病因。Hib结合疫苗降低了Hib发病率达80%或更多,这依赖于疫苗的普及程度。单价脑膜炎球菌C群（Men C）疫苗于1999—2000年上市,在英国降低了由Men C引起的侵袭性脑膜炎球菌病90%以上。

11价肺炎链球菌多糖-蛋白D结合疫苗在婴儿中的免疫原性和安全性[英]Narkka A…／／Pediatr Infect Dis J．

在过去的10年中，对于一系列以不同蛋白和多糖作为载体的多糖．蛋白复合物型抗肺炎链球菌疫苗的研究表明，在众多的疫苗中，只有1种带有CRM197载体蛋白的7价疫苗(PncCRM)能够有效地阻止致病性肺炎链球菌的感染。在欧美地区，这种疫苗广泛应用于高危人群，但其血清型是4、6B、9V、14、18C、19F和23F，缺少了亚洲等众多发展中国家普遍存在的血清型1和5。为了有效地抑制更多型别的肺炎链球菌，

通过CDAP活化多糖制备b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-D蛋白疫苗初探

目的用CDAP活化b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖,制备b型流感嗜血杆菌荚膜多糖及D蛋白疫苗。方法采用CDAP法在不同p H值条件下活化Hib荚膜多糖,再通过乙二酰肼(ADH)与D蛋白共价结合,制备Hib荚膜多糖与其D蛋白结合物原液,并对三批结合物原液的各项指标进行检测。获得的结合物原液免疫BALB/c小鼠,应用ELISA法检测血清中的Ig G抗体水平,评价其免疫原性。结果三批结合物原液以上检测指标均符合药典要求,衍生物中ADH含量对结合物的免疫原性有重要影响。结论用CDAP活化工艺制备的Hib荚膜多糖-D蛋白结合物适宜制备结合疫苗,为以D蛋白为载体的Hib结合疫苗的制备及五价联苗的研制奠定实验基础。

牛源金黄色葡萄球菌与无乳链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的研制与免疫原性研究

为了评价牛源金黄色葡萄球菌J581株和无乳链球菌A20株荚膜多糖蛋白结合疫苗的免疫原性,对制备的3批荚膜多糖进行了多糖、蛋白质及核酸含量检测,同时分别用纯化的J581和A20株荚膜多糖与破伤风类毒素偶联制备了质量浓度分别为5、10、15μg/m L的6种荚膜多糖蛋白结合疫苗及质量浓度各为10μg/m L的J581和A20株荚膜多糖蛋白结合混合疫苗,用这几种疫苗对小鼠进行免疫,采用间接ELISA方法及Ig G试剂盒对免疫前后不同时间段的小鼠血清进行抗J581和A20株荚膜多糖的特异性抗体水平及Ig G抗体效价检测。结果表明,制备的3批纯化荚膜多糖中,J581多糖平均质量浓度为49.78 mg/L,A20多糖平均质量浓度为55.76 g/L,2种多糖中蛋白和核酸含量均低于1%,符合疫苗生产要求;小鼠免疫试验结果表明,6种不同多糖含量的荚膜多糖蛋白结合疫苗和荚膜多糖混合疫苗均能刺激机体产生一定水平的特异性抗体效价及Ig G抗体,且在第28天抗体水平达到最高,其中荚膜多糖蛋白混合疫苗组中J581和A20抗体效价及特异性Ig G水平均显著高于6种单疫苗组(P<0.05)。本研究为研制金黄色葡萄球菌和无乳链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗奠定了基础。

霍乱O139血清群多糖结合疫苗的生物合成研究

目的:霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性传染病,其防治已成为一个全球性的公共卫生问题。其中1992年出现的O139血清群是除O1外另一种病原体,发病数日益增多。因此,有必要寻找一种安全有效适用于各种人群的疫苗。方法:敲除霍乱弧菌O139血清群93-3株脂多糖合成途径中O抗原连接酶基因waa L,在周间质产生游离的多糖,之后转入包含来自脑膜炎奈瑟球菌的糖基转移酶和霍乱毒素B亚单位(CTB)编码序列的共表达载体,经IPTG诱导后制备全菌蛋白样品,利用抗His抗体检测糖蛋白的表达,利用Ni柱和离子交换柱对糖蛋白进行纯化,并对其进行糖定量和蛋白定量。结果:以未糖基化、相对分子质量约为14×103的底物蛋白CTB为对照,当共表达CTB和糖基转移酶Pgl L时,通过Western印迹可检测到相对分子质量约为20×103的糖基化蛋白,经Ni柱及阳离子交换柱纯化,得到纯度较高的O139群霍乱O抗原多糖结合蛋白,其纯度约为84.2%,并计算得其糖-蛋白比为0.103∶1。结论:通过生物法合成了一种霍乱O139血清群的多糖结合疫苗,为后续进行动物评价打下了基础。

23F型肺炎球菌多糖与CRM197蛋白结合物制备及特性研究

目的采用改良胺化还原法,白喉无毒突变体CRM197蛋白作为载体,制备23F型肺炎球菌多糖蛋白结合物。方法在还原胺法的基础上,以1,6-己二酰肼(ADH)为分子臂,在碳二亚胺(EDAC)作用下衍化CRM197蛋白,衍化后蛋白再与多糖上的醛基反应,形成共轭结合;采用高效液相色谱技术(HPLC)、免疫扩散等方法分析结合物,并将获得的结合物免疫NIH小鼠,用ELISA方法检测多糖IgG水平。结果 HPLC图谱和免疫扩散检测结果证明了结合物的获得;动物免疫产生了较多糖高的抗23F肺炎多糖抗体,并有免疫记忆发生。结论采用改良还原氨化法可以制备出动物免疫原性良好的23F型多糖蛋白结合物。

脑膜炎奈瑟菌的候选蛋白质疫苗

脑膜炎奈瑟菌是引起脑膜炎、菌血症等侵袭性疾病的重要病原菌，也可以无症状的鼻咽部带菌状态存在。分为13个血清群，但只有6个群（A，B，C，W-135，Y和X）与其致病性有关。目前应用的疫苗主要是荚膜多糖疫苗和多糖蛋白结合疫苗。两者本质上都属荚膜多糖抗原，覆盖的血清群有限，无法做到对B群脑膜炎奈瑟菌的预防，因此发展通用蛋白质疫苗势在必行。能作为候选疫苗的具有免疫原性的蛋白质需具备以下特点：在大多数菌株中都表达且结构保守；可诱生杀菌抗体或保护性抗体。

2007-2020年中国多糖结合疫苗使用现状

目的分析中国多糖结合疫苗使用现状。方法从中国药品检定部门网站、国家免疫规划信息管理系统和中国统计年鉴收集2007-2020年多糖结合疫苗批签发量、2014-2020年报告接种剂次数和出生人口,分析疫苗批签发量,估算出生儿童多糖结合疫苗人均接种剂次。结果2007-2020年中国多糖结合疫苗共批签发46120.4万剂,年均上升5.53%;其中TT、CRM_(197)、OMP载体蛋白的疫苗分别占92.63%、6.69%、0.68%。2014-2020年出生儿童人均接种多糖结合疫苗1.46剂,从2014年的1.17剂上升至2020年的2.51剂;东部、中部、西部地区人均接种剂次分别为1.84剂、1.62剂、1.13剂。结论2007-2020年中国多糖结合疫苗使用量逐年增加,东部地区疫苗覆盖水平相对较高。需完善多糖结合疫苗免疫策略以指导其合理使用。

脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研究进展

脑膜炎球菌多糖结合疫苗基本采用化学结合方式制备,最常用的方式为酰胺缩合反应,由于多糖与蛋白以共价键形式结合,因此制备的结合疫苗稳定性较高,具有较好的技术优势,在脑膜炎球菌相关疾病预防中发挥重要作用。脑膜炎球菌多糖结合疫苗应用于2岁以内婴幼儿的免疫接种,保护效果持久。本文就脑膜炎球菌多糖结合疫苗制备的影响因素、多糖与载体蛋白的结合方式、国内外现状以及制备过程中存在的问题进行综述。

以蛋白为基础的新型肺炎球菌疫苗的安全性、反应原性和免疫原性:Ⅰ/Ⅱ期随机临床研究

背景：含有高度保守的肺炎球菌蛋白,例如肺炎链球菌溶血素类毒素（d Ply）和三联组氨酸蛋白D（Pht D）都正被开发出来以期提供抗肺炎球菌病的保护。这项研究评价了不同的含肺炎球菌蛋白的疫苗配方制剂的安全性、反应原性和免疫原性。试验在成人中进行。方法：在Ⅰ期双盲临床试验中,健康成人（18~40岁）被随机（1∶2∶2∶2∶2∶2∶2）分组,按2个月间隔，接受6种待测疫苗配方制剂中的一种制剂。