Flower Development and Anatomy of Agapanthus praecox ssp. orientalis (Leighton) Leighton

Floral buds of Agapanthus praecox ssp. orientalis were observed under dissecting and optical microscope to characterize floral organs development and to study relationships between anther development and microsporogenesis. Floral organs differentiation was comprised of 6 distinct stages including nought differentiation, inflorescence bud differentiation, floret primordia differentiation, tepal primordia differentiation, stamen primordia differentiation, and pistil primordia differentiation. Six tepals differentiated almost simultaneously which cross arranged in space and appeared in hexagonal distribution pattern. Six stamens were differentiated inside the tepals at the same time. Finally, 3 carpel primordia differentiated and formed syncarpous pistil. The whole process of floral bud differentiation took approximately 40 d with the first 3 stages developing more slowly than the later 3 stages. Morphology and color of the anther underwent obvious changes during the period between stamen primordia differentiation and anther maturation. Microspores also underwent significant development during this same interval. The relationship between the process of microsporogenesis and anther development has already been made clear by the sauash techniaue.

百子莲组培快繁与植株再生

以百子莲为试材,研究了百子莲的无菌播种、组培快繁及植株再生。结果表明:百子莲成熟种子最佳的消毒方法:70%酒精消毒1min,然后用0.1%HgCl2灭菌3min。将种子接种在不添加植物调节剂的MS培养基上,发芽状况良好;切取幼苗基部进行增殖培养,增殖的最佳培养基为MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L。最佳外植体为去根的无菌苗,最佳不定芽分化培养基为MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L,其不定芽分化率达92%。在1/2MS+IAA0.5mg/L培养基上,生根率达80%。驯化移栽后,其成活率达90%。

百子莲CONSTANS同源基因的克隆及表达分析

根据前期百子莲转录组测序分析的结果，获得了1个与光周期调控开花途径关键基因CONSTANS（CO）同源性较高的核心片段。采用cDNA末端快速扩增（RACE）方法得到了百子莲CO基因eDNA全长序列，命名为却COL，GenBank登录号为KF683287。序列分析表明，百子莲ApCOL基因eDNA全长1648bp，5’非编码区（5’UTR）和3’非编码区（3’UTR）分别为126和355bp，开放阅读框（ORF，127～1293bp）1167bp，编码388个氨基酸。ApCOL具有CO蛋白典型的结构域：氨基末端有2个B-box结构域，羧基末端有1个CCT保守结构域。氨基酸同源性比对发现，ApCOL与葡萄（XP_002274384．2）、可可（EOX99181．1）和大豆（NP001241023．1）等植物的CO蛋白有很高的相似性，同源性均在50％以上。系统进化树分析表明，ApCOL与小麦CO（EMS51329．1）聚类关系最近。实时荧光定量qRT-PCR结果表明：叶片中apCOL的表达量在花芽分化3个时期均高于花芽中的表达量，且叶片中的最高表达量和花芽中最低表达量均出现在花芽诱导期；在整个初花期内，各器官中却COL表达量由高到低依次是花梗、叶片、幼果、子房、花瓣、茎和花葶，花梗中表达量分别为叶片和茎中的2．68和114．3倍；不同光周期处理的叶片中ApCOL基因表达模式相近，均在暗处理时期呈现高表达。说明该基因的表达具有明显的时空差异性和生物钟调节特性，推测却COL在百子莲成花过程中以及花发育过程中发挥着一定的作用。

百子莲种子发育生理生化特性

为了解引种植物百子莲种子发育过程中生理生化特性,有针对性地进行种子繁殖,采用测量观察和生理试验方法,对种子长度、质量、含水量和种子中淀粉、可溶性蛋白质以及过氧化物酶、多酚氧化酶、α-淀粉酶的质量分数进行测定,结果表明:百子莲种子发育前2周种子生长量最大;种子干质量在授粉后42d趋于稳定。淀粉在种子发育初期积累迅速,总体上呈"上升—下降—上升"的趋势;可溶性蛋白质质量分数呈逐渐上升趋势;可溶性糖质量分数呈逐渐下降趋势。淀粉质量分数、可溶性蛋白质质量分数与种子干质量、种子大小呈显著正相关;可溶性糖质量分数与淀粉质量分数、种子干质量、种子大小呈显著负相关。POD、PPO、α-淀粉酶的质量分数在种子发育过程中变化显著,POD、PPO活性与可溶性蛋白质质量分数呈显著正相关;α-淀粉酶活力与种子大小呈显著正相关。

百子莲花期调控技术研究

以4年生盆栽百子莲为试材,研究了控温栽培和喷施外源生长调节物质对其开花的影响。结果表明:控温栽培百子莲花芽分化明显提前,花芽分化速率加快,变温处理组花期提前50—66 d,小花数量减少25.5%,花序直径缩短27.2%。生长素PP_(333)50 mg/L可使花期推迟12 d;矮壮素1 200 mg/L处理花期提前8 d,小花数量增加27.7%,植株高度缩短29.4%。本研究可为百子莲等观赏植物的定向花期调控提供科学依据。

遮光处理对大花百子莲叶片结构特征和光合特性的影响

在全光照、30%、60%和80%遮光条件下,对引种植物大花百子莲叶片结构特征和光合特性进行了研究。结果表明:遮光处理后,大花百子莲叶面积随遮光率增加而逐渐增加,叶片厚度和比叶重则随遮光率增加而逐渐减小。气孔器长度随遮光率增加有逐渐变大的趋势,而气孔密度的变化趋势却相反。同时,4种光强条件下,叶绿素含量随着遮光程度的提高不断增加,叶绿素a/b值有小幅下降,说明大花百子莲叶片能够适应隐蔽环境并逐渐向阴性植物特征转变;大花百子莲光饱和点均低于1000μmol·m-·2s-1,光补偿点均低于20μmol·m-2·s-1,这一结果与耐荫性植物的一般指标一致,表明大花百子莲在有限的光照条件下能最大可能地利用低光量子密度进行光合作用。

大花百子莲的开花物候与生殖特性

连续2年对引种植物大花百子莲在中国上海市人工种群的开花物候、结实情况进行观测记录，从不同水平分析了大花百子莲的开花物候对其生殖的影响。结果显示：（1）大花百子莲在引种地的开花时间为6月初至7月末；种群花期历时40d左右，单株花期在14～31d波动，单花寿命主要为2～3d；2年的开花振幅平均在6朵·株^-1·d^-1左右，花朵开放百分率值在3．69％～4．87％左右，平均开花式样为11～17朵。（2）大花百子莲种群内2007年比2008年的各项开花物候指标均提前6～9d；种群开花进程为渐进式的双峰曲线；种群花期重叠时间较长，2年的平均开花同步指数分别为0．663、0．695；植株个体相对开花强度主要分布频度为50％～70％。（3）开花物候指数与座果率的相关分析表明，始花时间与开花数目、座果数、花期长度呈显著负相关关系，开花数目与座果数、花期长度以及花期长度与座果数均呈显著正相关关系，同一花序内单花所发育成果实的数量与单花开放时间呈极显著负相关关系。研究表明，大花百子莲始花时间早的植株比始花时间晚的植株花期更长，开花数目多的植株比开花数目少的植株花期更长，花期长的植株比花期短的植株座果率更高；而且在同一花序上，越早开放的单花其结实的可能性越大。作为引种植物，大花百子莲开花物候年度间具有相似性，说明其在引种地可以适应环境压力，形成稳定的开花时间与开花模式；较长的花期重叠和大量的开花数目可以吸引较多的传粉者访问，为其生殖成功奠定了良好基础。

百子莲花芽分化过程中DNA甲基化的差异分析

以4年生盆栽百子莲为试材,利用MSAP技术,对百子莲营养芽、诱导芽、花序芽进行甲基化水平和模式分析,以探讨其开花的表现性状与其基因组甲基化修饰的关系。结果表明:从64对引物中选出36对引物,分别获得292、310、323个电泳条带,其中无甲基化或单链内甲基化分别是184、204、210条,双链内甲基化条带分别是93、108、107条,超甲基化条带数分别为76、63、58条。3个样品中总体甲基化比例分别为61.34%、60.31%和60.60%,该研究可为百子莲植株的分子鉴定、良种选育与栽培,以及遗传演化等提供新思路。

多效唑对百子莲花葶矮化效应的研究

以3年生盆栽百子莲品种‘Big Blue’为试材,研究不同浓度的多效唑对百子莲花葶生长、细胞形态和生理指标的影响。结果表明,不同浓度的多效唑处理对百子莲花葶生长和细胞纵向生长均有不同程度地抑制作用,且花葶长度随着多效唑浓度的增加而呈下降趋势。其中以400mg/L的多效唑处理效果最佳,其花葶长度比对照平均缩短了61.1%。另外,由相关性分析得出花葶长度与其上、下部细胞长度极显著正相关,相关系数为0.772和0.806。由切片组织化学分析和生理指标测定结果表明,多效唑处理明显提高了花葶中可溶性蛋白、可溶性糖和淀粉的含量。

百子莲体细胞发育受体激酶APSERK1(Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1)基因全长克隆及表达分析

根据前期百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis)转录组测序分析的结果,获得了1个与胚性能力相关的关键基因Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1(SERK1)同源性较高的核心片段。采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法得到了百子莲SERK基因cDNA全长序列,命名为ApSERK1。序列分析表明,百子莲ApSERK1基因开放阅读框(ORF)为1800bp,编码1个含有600个氨基酸的蛋白质。氨基酸同源性比对发现,百子莲ApSERK1蛋白序列与水稻、小兰屿蝴蝶兰、铁皮石斛、椰子树和菠萝等植物蛋白序列的相似性可达到90%以上。实时荧光定量qRT-PCR结果表明,ApSERK1基因有一定时空表达差异,在百子莲的种子、小花梗中表达含量最高,且随着外源生长素浓度的增加,胚性愈伤组织的胚性能力呈现下降趋势。推测ApSERK1基因是衡量植物细胞胚性能力的重要指标。

百子莲生长素受体基因TIR1的全长cDNA克隆及功能分析

采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法获得百子莲生长素受体TIR1基因cDNA全长序列,对该序列进行生物信息学分析的结果显示,TIR1基因的mRNA序列全长为2 235bp;5’非编码区296bp,3’非编码区172bp;该基因的ORF全长为1 764bp,编码一个含有588个氨基酸的蛋白。百子莲TIR1推导蛋白序列与葡萄(Vitis vinifera)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、高粱(Sorghum bicolor),玉米(Zea mays)等植物均具有较高的同源性,同源性最高的是葡萄,可达78%。系统进化树表明,百子莲与葡萄距离最近。由α-螺旋,随机卷曲和延伸链组成一个磁状结构,为亲水蛋白,疏水性值为-0.092,在百子莲体细胞胚胎发生过程中,实时荧光定量PCR结果表明TIR1基因表达量在愈伤组织中含量最低,在胚性愈伤组织和体细胞胚胎中含量均有所升高,而在体胚幼苗中表达量最高,表明该基因介导的生长素信号在体细胞胚胎发生过程中发挥着非常重要的作用。

百子莲的花部特征与繁育系统观察

通过观察,运用杂交指数、花粉、胚珠比、人工授粉和套袋试验等方法,对上海市引种的处于半自然状态的百子莲(Agapanthus praecox ssp. orientalis‘Big Blue’)的开花状态、繁育系统进行了研究。结果表明:百子莲单花花期一般2～3d,花药全部开裂需要3～5h。开花过程中柱头与花药无明显空间隔离现象,雄蕊先于雌蕊成熟。杂交指数等于4,花粉—胚珠比等于25622,结合人工套袋和授粉试验的结果,可以确定该物种的繁育系统属于异交为主,部分自交亲和,传粉过程需要传粉者。

百子莲ApCathB启动子克隆及其对超低温保存的响应分析

组织蛋白酶B基因(ApCathB)是影响百子莲胚性愈伤组织超低温保存冻存率的关键基因,为探究ApCathB如何响应超低温保存复合逆境,利用染色体步移法扩增获得ApCathB的启动子序列,使用PlantCARE在线软件分析该启动子中含光、激素和非生物胁迫相关的顺式作用元件。将ProApCathB::GUS表达载体转化拟南芥,获得转基因植株,GUS组织化学染色表明ApCathB启动子在拟南芥幼苗时期和小花等部位活性较高,在成熟叶中较低。转基因拟南芥萌发60 h幼苗在超低温保存处理过程中,GUS基因和蛋白的表达量在脱水处理后显著提高,暗示ApCathB启动子受到脱水处理的诱导进而响应超低温保存复合逆境,这为进一步研究ApCathB在百子莲超低温保存中的功能及其相关调控机制提供了数据参考。